摘要目的 构建以绵羊李斯特菌(Listerria ivanovii,LI)为载体的表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)特征性抗原蛋白的疫苗候选菌株,并评价其生物安全性和免疫效果.方法 将MTB早期感染、潜伏感染和复发阶段的4种抗原基因的细胞表位串联形成融合抗原基因,即多阶段结核杆菌抗原基因,命名为msv.将msv插入含有LI同源序列的打靶质粒,利用同源重组技术构建基因组整合msv抗原基因的重组LI菌株.观察重组菌株的体外生长情况,通过Western blot验证靶抗原蛋白的表达情况,测定重组菌株对C57BL/6小鼠的半数致死量(50％ lethal dose,LD50),以0.1×LD50为免疫剂量,通过尾静脉接种小鼠,通过接种前及接种后1、2、3、5、7、14d的血清谷丙转氨酶(ALT)水平、脏器载菌量和脏器病理切片评价疫苗候选株的安全性.为测定疫苗候选株的免疫效果,另取3组小鼠分别尾静脉免疫LI-msv、LI、NS,免疫后第9天制备脾悬液,流式细胞术检测分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)等细胞因子的CD4+T细胞和CD8+T细胞水平.结果 成功构建能表达多阶段结核杆菌抗原的疫苗候选株LI-msv.LI-msv对C57BL/6小鼠的LD50为3.3× 108 CFU/只.通过尾静脉接种小鼠后,LI-msv主要在小鼠肝脏和脾脏内短期繁殖,7d后能被机体清除,对肝、脾的病理损伤时间短且可恢复;流式细胞术检测结果表明接种LI-msv的小鼠脾淋巴细胞分化出了特异的IFN-γ+ CD4+T细胞和IFN-γ+ CD8+T细胞,阳性细胞比率较相应载体对照组和生理盐水对照组高(P＜0.005);特异性TNF-α+CD4+T细胞比率高于相应载体对照组(P＜0.01)和生理盐水对照组(P＜0.005),TNF-α+ CD8+T细胞比率高于生理盐水对照组(P＜0.005).结论 成功构建了一株以LI为载体的表达结核杆菌多阶段抗原的疫苗候选株.该菌株具有生物安全性,且能诱导一定的特异性细胞免疫应答,有望作为结核疫苗候选株进行深入研究.