换一批STGC3基因突变载体的构建及其在CNE2细胞中的表达
Construction of the STGC3 recombinant mutation vector and its expression in CNE2 cells
摘要目的 :构建STGC3基因单碱基位点突变载体并观察CNE2细胞中STGC3蛋白表达情况,为探讨STGC3基因发挥抑瘤作用的功能性位点提供前期基础.方法 :针对STGC3基因糖基化、蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化3个(656C、725C、913T)可能性功能位点,运用Stratagene定点突变技术,对STGC3基因656C、725C、913T位点分别进行单碱基定点突变,使656C突变为G,725C突变为T,913T突变为G,构建突变表达质粒,同时构建野生型质粒为对照.质粒经转化、抽提、酶切及测序鉴定.将重组真核表达质粒,用脂质体转染至鼻咽癌CNE2细胞系,经G418筛选,得到稳定表达STGC3基因3种突变型CNE2细胞系.实验设6组,即空白对照组(Negative control)、空载体组(Vector)、野生型组(His-STGC3)和3个STGC3基因突变型组(His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T、His-STGC3-T913G).运用RT-PCR、免疫印迹及免疫细胞化学,观察重组质粒突变型STGC3基因是否正常表达.结果 :突变质粒经酶切和测序鉴定,酶切结果显示目的片段大小一致,测序结果显示突变序列正确,成功构建带His标签的3个突变型(His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T、His-STGC3-T913G)重组真核表达质粒.RT-PCR、免疫印迹和免疫细胞化学结果显示,突变质粒均正常表达His-tag-STGC3基因及融合蛋白质,融合蛋白定位于细胞质和细胞核.结论 :成功构建STGC3基因单碱基位点突变质粒,并在CNE2细胞中表达STGC3融合蛋白.
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DOI
10.3969/j.issn.1001-1633.2019.05.005
发布时间
2019-11-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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