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基于超高效液相色谱-质谱法的肽段分析中非特异性吸附评估及通用型最小化策略

Nonspecific adsorption evaluation and general minimization strategy in peptide analysis based on ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry

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摘要蛋白质组学技术在多肽和蛋白质类新型治疗药物的开发、临床诊断生物标志物的深入发掘中应用广泛.然而,多肽和蛋白质类大分子的非特异性吸附性质给分析方法的开发带来极大挑战,亟须一种通用型的策略去评估和降低非特异吸附对超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)大分子检测造成的负面影响.研究以牛血清白蛋白(BSA)为模型,探讨其酶解后多肽组理化性质与吸附程度之间的相关性;根据肽段的响应和吸附程度设计分级策略;针对高响应、强吸附的ClassⅡ类肽段,从样品制备中离心管、进样瓶的选择,乃至液相色谱系统中色谱柱固定相、流速、梯度、柱温、洗针液的选择全过程设计试验,探讨非特异吸附的影响因素及其通用型最小化策略.结果显示,肽段的被吸附程度与其理化参数HPLC指数(HPLC Index)、肽段长度等显著相关(p<0.05),但仅凭上述参数仅能解释30％肽段的被吸附程度.改性的聚丙烯材料可使肽段溶液在储存或前处理过程中获得较高的回收率(24 h内回收率大于80％).在对液相色谱条件的考察和优化过程中发现,C8填料的色谱柱、高流速、缓梯度以及强洗针液,可使残留量降至最低(降低为原来的1/150).柱温对残留的影响在肽段间存在较大个体差异,需要对不同的肽段具体分析以得到较少量的残留.研究以详实的数据考察并最小化模型肽段组在分析过程中的非特异吸附,提示了蛋白质类大分子药物分析方法建立中应重点关注的影响因素及其有效的解决方案.