摘要Rag GTPase属于Ras家族成员的GTP结合蛋白,定位于溶酶体.果蝇RagA蛋白是哺乳动物RagA/RagB蛋白同源物,在果蝇中RagA与RagC结合,共同调节TORC1 活性.本实验室发现敲减RagA使果蝇发育停滞在蛹期.为了探究具体原因,基于密码子的简并性,通过融合PCR、同源重组克隆的方法构建了改变RagA RNA干扰靶标位点的过表达载体pUASp-RagA-wt;在此基础上,通过点突变的方式构建了与GTP结合的RagA过表达载体pUASp-RagA-Q61L和与GDP结合的RagA过表达载体pUASp-RagA-T16N.通过显微注射和遗传杂交等方式分别筛选出pUASp-RagA-wt、pUASp-RagA-Q61L、pUASp-RagA-T16N转基因果蝇.通过体细胞克隆的方法检测了不同活性状态的RagA对TORC1 活性的影响,RagA调节TORC1 活性:与GTP结合处于激活态;与GDP结合处于失活态.为确定GTP/GDP状态下RagA活性对果蝇发育的影响,将UASp转基因系果蝇与Tub-Gal4/TM6 果蝇杂交并统计后代羽化率,判断由GTP/GDP状态控制的RagA活性对果蝇生长发育的影响.结果发现,RagA敲减果蝇由于蛹期阶段内出现障碍不能发育为成虫.在RagA敲减的背景下,过表达野生型RagA能够完全挽救RagA敲减所导致的果蝇致死.过表达GTP结合型的RagA-Q61L能够部分挽救RagA敲减的致死效应,过表达GDP结合型的RagA-T16N不能挽救RagA敲减的致死效应.表明RagA在果蝇生长发育过程中起着重要的作用,且RagA与GTP/GDP结合需保持动态平衡.RagA仅与GTP或GDP结合会使TORC1 活性处于过高或过低的状态,影响果蝇的生长发育.