换一批应用CRISPR/Cas9 技术建立ERK激酶相分离荧光探针定点整合的稳定细胞株
Establishing a Stable Cell Line with Site-specific Integration of ERK Kinase Phase-separated Fluorescent Probe Using CRISPR/Cas9 Technology
摘要旨在构建人AAVS1位点定点敲入的诱导表达型ERK-SPARK激酶荧光探针的人食管鳞癌细胞株(KYSE-150).根据AAVS1 位点的DNA序列设计和已公开ERK-SPAEK荧光探针碱基序列构建了两端带有 750 bp同源臂的诱导型ERK-SPARK表达盒的同源重组供体质粒.其次,利用在线设计工具设计了 3 个靶向AAVS1位点的 sgRNA,并克隆至 pX330 骨架质粒中得到 3 个能定点切割AAVS1 位点的CRISPR/Cas9 打靶载体,将同源重组供体质粒分别与表达CRISPR/Cas9 打靶载体共转染KYSE-150 细胞,经Dox诱导表达 24 h后进行嘌呤霉素抗性筛选和流式细胞分选,得到抵抗嘌呤霉素且表达GFP的细胞亚群.再应用 PCR鉴定基因型,以及 Western blot 检测蛋白表达.对获得的细胞群提取基因组DNA并进行PCR基因型鉴定,结果显示获得片段的大小与诱导型ERK-SPARK表达盒的大小一致.蛋白表达检测结果显示,该细胞群表达了ERK-SPARK探针融合蛋白.荧光探针成像实验结果显示,在未经Dox诱导表达条件下,细胞株有极少量泄漏表达;经Dox诱导表达后,GFP荧光蛋白在细胞质内均匀分布,无明显聚集成点现象;在加入EGF激活ERK激酶后,原本在细胞质内均匀分布的GFP绿色荧光聚集成高亮度的绿色液珠.成功获得了可诱导表达检测ERK激酶活性的SPARK荧光探针的稳定细胞株,解决了瞬时表达ERK-SPARK探针效率不稳定影响实验结果准确性的问题,为后续建立基于SPARK技术的高通量蛋白激酶抑制剂的筛选平台奠定了前期研究基础.
更多相关知识
关键词
CRISPR/Cas9AAVS1 安全港同源重组SPARK荧光探针稳定细胞株KYSE-150 细胞细胞外调节蛋白激酶表皮生长因子CRISPR/Cas9AAVS1 safe harborhomologous recombinationSPARK fluorescent sensorstable cell linesKYSE-150 cellsERKEGF
栏目名称
DOI
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0173
发布时间
2023-09-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
- 浏览28
- 被引1
- 下载0
相似文献
- 中文期刊
- 外文期刊
- 学位论文
- 会议论文
