摘要背景:血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白具有协同促进血管生成的作用.目的:构建在真核细胞中表达人血管内皮生长因子165的红色荧光蛋白表达载体和携带人骨形态发生蛋白2的绿色荧光蛋白表达载体,共转染真核细胞以研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在293-T细胞内的表达和定位.设计:随机对照实验.单位:解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室.材料:实验于2002-09/2004-03在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室完成.pCDNA3.1(+)/骨形态发生蛋白2由美国UCLA大学Dr.Bostrom惠赠;pDsRed1-N1由Professor Roger Y.Tsien,University of California,San Diego,USA惠赠.pUC18/血管内皮细胞生长因子165,293-T cells由本实验室保存.方法:根据已知的人血管内皮生长因子165序列,设计在目的片段两端分别携带酶切位点的两条引物,用聚合酶链反应从质粒pUC18/血管内皮生长因子165中扩增出去除终止密码子的人血管内皮生长因子165片段,定向克隆至含报告基因的质粒pDsRed1-N1中,构建重组质粒pDsVEGF165Red1-N1;同时,构建pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白表达载体.以DOTAP为介导,将重组质粒共转染293-T细胞,48 h后用激光共聚焦显微镜检测报告基因红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白的表达,使用反转录聚合酶链反应及免疫印迹方法检测血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内表达.主要观察指标:质粒的酶切鉴定及重组质粒在293-T细胞中mRNA及蛋白水平的表达.结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应和DNA序列测定证明构建正确,目的基因在293-T细胞中在mRNA及蛋白水平获得表达.激光共聚焦显微镜观察到红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白在细胞内共定位的情况.结论:成功构建pDsVEGF165Red1-N1和pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白2种含报告基因的真核表达载体,两者共转染后能在真核细胞中表达,为研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内的相互作用提供了一个重要而方便的工具.