换一批禽白血病J亚群病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
Development and Application of Real-time PCR for Detection of Avian Leukosis Virus Subgroup J
摘要本研究旨在通过荧光定量PCR方法研究禽白血病J亚群病毒(ALV-J)在家禽体内各个器官的分布.根据ALV-J NX0101毒株基因5 258- 5 510 bp的碱基序列,设计了1对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为253 bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green Ⅰ染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性,特异性和重复性试验.然后用已建立的方法对人工感染ALV-J的SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、腺胃进行3次重复检测,将Ct值带入标准曲线公式得出各个组织的病毒拷贝数.试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.991 4,检测极限约为81拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上；特异性分析表明只有ALV-J能检测到特异性的熔解度峰值；批内和批间重复性试验的变异系数均小于5％.通过比较数值以得出胸腺ALV-J基因含量是最高的,肺脏、脾脏、法氏囊含量也比较高,心脏拷贝数最低.自然感染发病鸡各器官ALV-J基因均高于人工感染ALV-J的基因含量.本研究所建立的ALV-J基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,初步探讨了禽白血病J亚群病毒在畜禽体内各个器官的病毒分布.这为以后禽白血病的诊断以及治疗提供了重要的技术支持.
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