CDH1基因1018位点突变对乳腺癌非同源末端连接修复途径的影响及作用机理研究

Effect of CDH1 gene 1018 site mutation on non-homologous end joining repair pathway in breast cancer and its mechanism

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摘要背景与目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤.发现并排查乳腺癌的致病突变基因,可能达到防治乳腺癌的目的.本文旨在研究上皮钙黏蛋白编码基因(E-cadherin gene,CDH1)及其1018位点突变型在DNA损伤修复模型中的作用.方法:检测乳腺癌先证者及其家系成员血液DNA样本,发现CDH1基因的1018位错义突变c.1018A>G(p.Thr340Ala)符合遗传学定律,疑似致病突变.在此基础上,构建CDH1基因敲除的MDA-MB-231乳腺癌细胞系,将构建的CDH1-1018突变质粒与非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)报告系统共同转染进入细胞中,通过MTT法检测细胞增殖,采用流式细胞术检测NHEJ报告系统荧光率,反映CDH1基因1018位点突变对DNA损伤修复的影响,最后采用蛋白质印迹法(Western blot)对NHEJ修复途径中及乳腺癌相关的关键蛋白进行分子验证.结果:采用CRISPR/cas9系统对CDH1基因进行敲除,成功构建CDH1基因敲除细胞系;将NHEJ报告系统与CDH1基因质粒及CDH1-1018位突变质粒转染进入细胞,经i-sceⅠ酶切,测得CDH1基因1018位突变体细胞株在DNA损伤修复过程中的效率明显降低,Western blot验证了该突变对NHEJ途径重要蛋白以及乳腺癌相关蛋白表达均有抑制作用;MTT实验表明CDH1基因1018位点突变后,细胞增殖效率减缓.结论:CDH1基因1018位点突变对NHEJ修复途径有抑制作用,其机制可能与细胞粘连及组织运动能力相关,抑制相关蛋白的招募过程,使表达减弱.