换一批
换一批摘要目的利用细菌内同源重组法构建含12密码子点突变的k-ras基因重组腺病毒.方法用限制性内切酶kpnⅠ+xhoⅠ从载体pcDNA3-k-ras 12(Val)中切出12密码子点突变的k-ras基因片断,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV/k-ras 12(Val),将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因重组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒Ad-k-ras 12(Val).采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果利用CaCl2法由pAdTrack-CMV/k-ras 12(Val)和pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,可获得25%左右的阳性重组体细菌克隆.PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1.2×1012pfu/ml.结论细菌内同源重组法构建腺病毒相比于传统的细胞内同源重组法,具有成功率高、方法简便、快捷、实验周期短的优点,值得进一步推广使用.
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