qPCR快速检测金黄色葡萄球菌及MRSA方法的建立及评价

Establishment and evaluation of a quantitative real-time PCR assay for rapid detection of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphy-lococcus aureus

二维码有效期 120s

摘要目的建立qPCR法快速检测金黄色葡萄球菌及其mecA基因,以期快速精准诊断金黄色葡萄球菌感染及初步判断耐药情况.方法从NCBI数据库下载金黄色葡萄球菌nuc、atl、icaB、fnbA、hla、srap基因序列用于鉴定标志筛选,mecA基因序列用于MRSA标志筛选;经DNA MAN比对后,选择各基因保守区分别设计1～2套引物、探针,建立单重及双重qPCR,用临床分离株及标准菌株筛选出检测性能最好的基因片段作为检测标志物,建立金黄色葡萄球菌鉴定和耐药双重qPCR检测方法,并进行性能评价.结果经筛选,金黄色葡萄球菌atl基因(CP009361.1:1010217～1010341)、mecA基因(KF058908.1:1715～1843)两片段检测性能最优,将其作为标志物建立双重qPCR法.该方法的检测下限均低至4 copies/反应;扩增线性范围均达2.0×102～8 copies/mL.335份金黄色葡萄球菌(含94份MRSA)培养阳性的患者样本中,qPCR法分别检出SA 335份,MRSA 94份;95份金黄色葡萄球菌培养阴性的患者样本中,qPCR法分别检出SA 17份,MRSA 4份,经PCR产物测序,与标准菌株同源性均≥90％.双重qPCR法从样品处理到报告结果≤2.0 h.结论 qPCR法方法简便、快速、灵敏度高、特异性好,可望提高金黄色葡萄球菌感染的诊断能力并实现快速检测,为尽早精准治疗赢得时间.