反义AFP增强子/TK基因重组逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞中的专一性表达

Construction of recombinant retrovirus vector bearing antisense AFP enhancer/TK gene and its hepatocyte-specific expression

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摘要目的构建在肝癌细胞中特异性高表达的重组逆转录病毒载体,观察其对体外培养肝癌细胞生物学行为的影响.方法应用DNA重组技术将α-甲胎蛋白强子(AFE)核心区DNA与单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因融合,反向插入逆转录病毒载体pLXSN,重组体命名为pL/TK/AFE/SN;经PA317细胞包装、G418筛选、病毒滴度测定,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩增培养,收获病毒上清,感染体外培养的Hap3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞.用Southern blot、Northern blot检测转染细胞的DNA、mRNA,以羟甲基无环鸟苷(GCV)对细胞的杀伤毒性检测外源基因在转染细胞中的表达.结果酶切及Southern blot证实插入pL/TK/AFE/SN的反义AFE/TK基因大小、方向及克隆位点正确.达到一定的产病毒滴度.Northern blot分析显示Hep3B肝癌细胞有TK基因mRNA水平表达;应用GCV后,导入反义AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞生长明显受抑制(P＜0.01).结论成功构建了含反义AFE/TK基因的重组逆转录病毒载体并包装出具有感染能力的假型逆转录病毒;重组载体所含的反义AFP 强子能调控外源性TK基因特异地在Hep3B肝癌细胞中高表达.