换一批
换一批乳链菌表达hGM-CSF基因的拼装及其载体pNCSF构建
Construction of vector pNCSF and assembly of hGM-CSF gene expressed in Lactococcus lactis in vitro
摘要目的 体外拼装适合在乳酸链球茵表达的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,hGM-CSF),并构建载体pNCSF.方法 根据hGM-CSF的氨基酸序列及乳酸链球菌偏好的密码子,将hGM-CSF基因外显子的全长碱基序列用DNAWORKS程序设计成16条互补的寡核苷酸片段,并且分别在第1条和第16条寡核苷酸片段上分别设计PstⅠ和BBamHⅠ酶切位点,将相同终浓度的寡核苷酸混合进行PCR反应,完成hGM-CSF基因拼接,得到目的 基因片段,对寡核苷酸片段进行拼装和扩增,产物稀释后进一步纯化扩增,在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T,然后TA克隆于pGEM T easy载体中,经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证.然后亚克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBCl000载体.结果 通过PCR得到420左右目的 DNA片段,获得了hGM-CSF和pNCSF阳性克隆,其DNA测序结果与设计序列完全一致.结论 运用基因拼装及克隆技术成功拼装了hGM-CSF基因及构建了载体pNCSF,为乳酸链球茵表达重组hGM-CSF奠定了基础.
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