换一批
换一批PRS-CTGF-SiRNA逆转录病毒载体及包装细胞株的构建
Construction of retrovirus expressing CTGF siRNA and its steady packaging cell line mediated by PRS retrovirus vector
摘要目的 用PRS逆转录病毒载体构建介导人结缔组织生长因子(CTGF)小分子干扰RNA(small interfering RNA,sRNA)表达的PRS-CTGF-SiRNA逆转录病毒载体,并建立高效、稳定表达CTGF-SiRNA的包装细胞株.方法 根据siRNA靶序列设计要求及PRS逆转录病毒载体特点分别设计含64bp DNA序列的4对寡核苷酸,并在体外合成.PRS载体用BglⅡ、HindⅢ双酶切完全后,分别与退火的4对寡核苷酸进行连接,构建成表达CTGF小分子干扰RNA的pRS-CTGF-SiRNA逆转录病毒载体.用脂质体2000介导转染PT67包装细胞,经抗性筛选,挑单克隆,扩大培养,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出高效产毒细胞株.结果 经酶切、连接后构建成的质粒称之为PRS-CTGF-SiRNA1～4,经酶切与测序证实构建成功,无任何碱基突变.经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和NIH3T3测定病毒滴度,筛选出具有高病毒滴度的细胞集落,扩大培养后建立CTGF-SiRNA高效表达的包装细胞株.结论 成功构建了能表达CTGFsiRNA的PRS-CTGF-SiRNA逆转录病毒载体,并建立了稳定、高效生产有活性的的CTGF-SiRNA产毒包装细胞株.
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