endostatin基因重组腺病毒的构建及在人肺腺癌细胞的表达

Construction of recombinant adenovirus vector expressing murine endostatin gene and its effect on human lung adenocarcinoma cell line SPCA-1

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摘要目的利用AdEasy系统构建鼠内皮抑素(ES)基因重组腺病毒Ad.ES,并观察其在人肺腺癌细胞SPCA-1的表达.方法采用酶切、连接和转化等方法,将质粒pcDNA3.ES中的ES片段插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV.ES,经Pme Ⅰ酶切线性化后与含腺病毒基因骨架的质粒载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内进行同源重组得到腺病毒质粒pAd.ES,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后,转染人胚肾293细胞包装成腺病毒颗粒Ad.ES,将病毒上清反复感染293细胞获得高滴度病毒,应用氯化铯(CsCl)梯度离心的方法纯化病毒,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白(GFP)标签测定重组腺病毒的功能滴度.用2 MOI重组腺病毒Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h,流式细胞仪检测GFP表达阳性率,ELISA法测定细胞培养上清液中ES的含量.结果双酶切证实重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV.ES质粒构建正确,卡那霉素抗性筛选和Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d,约20%的细胞表达GEP,回收病毒重复感染293细胞,CsCl梯度离心纯化最终获得约5.6×1010TU/mL滴度的重组病毒.Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h后,细胞GFP阳性率为93%,细胞培养上清液中ES的含量较Ad.GFP感染组和阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论应用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和ES的重组腺病毒,Ad.ES体外感染人肺腺癌细胞SPCA-1可显著提高ES表达,为进一步研究抗血管生成治疗肺癌奠定了基础.