换一批
换一批重组腺病毒pAdxsi-eGFP-rNIS的构建及初步应用
Construction of recombinant adenovirus with pAdxsi-eGFP-rNIS and initial application
摘要目的 构建包含rNIS和eGFP基因的重组腺病毒栽体及初步应用.方法 以CMV为启动子,将pShuttle-eGFP-CMV重组穿梭载体和含有目的 基因rNIS的原始质粒酶切后,电泳、切胶回收,分别得到载体片段和插入片段.连接酶连接两种片段后,转化化学感受态DH5a菌株,涂布到抗性固体培养基中;挑取单克隆菌落,接种到抗性液体培养基培养;提取pShuttle-eGFP-CMV-rNIS重组穿梭质粒,酶切鉴定.用类似的方法将pShuttle-eGFP-CMV-rNIS重组穿梭质粒转移到pAdxsi重组腺病毒骨架栽体上.在细菌内扩增培养后,提取pAdxsi-eGFP-rNIS病毒质粒,酶切鉴定.将最终的重组腺病毒Ad-eGFP-rNIS转染到A549细胞,荧光显微镜下观察、拍照;细胞与125I溶液培养后,γ计数器检测细胞放射性计数.结果 rNIS构建到pShut-tle-eGFP-cMV(-)TEMP重组穿梭质粒中,并成功转移到pAdxsi重组腺病毒骨架载体上,经酶切鉴定,rNIS和eGFP均表达正确.荧光显微镜下,转染Ad-eGFP-rNIs的A549细胞可见大量强烈绿色荧光,未转染细胞未见明显绿色荧光.转染细胞摄取放射性计数为(29 250±1 441)cpm,未转染细胞摄取放射性计数为(490±27)cpm,两者之间的差异有统计学意义,t=15.2,P<0.001.结论 成功构建了含rNIS基因的重组腺病毒载体,转染肿瘤细胞后rNIS功能正常,为下一步rNIS介导的肿瘤基因靶向治疗及分子显像奠定了基础.
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分类号
Q782
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.1005-8982.2010.07.012
发布时间
2010-07-13
基金项目
中国博士后科学基金（20090450935）；
湖南省科技厅资助项目（08FJ3167）
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