叉头状转录因子O1基因过表达慢病毒载体构建及其大鼠系膜细胞株的建立
Construction of lentiviral vectors targeting FoxO1 gene and overexpression of FoxO1 in rat mesangial cells
目的 构建含组成性激活突变型FoxO1(CA-FoxO1)基因的过表达慢病毒载体,并建立其过表达的大鼠肾小球系膜细胞株.方法 通过四质粒合成法构建包含CA-FoxO1编码序列的过表达慢病毒载体(LV-CA-FoxO1).实验分为3组:空白对照组(NC组)、空慢病毒载体阴性对照组(LV-empty-FoxO1组)和过表达慢病毒载体组(LV-CA-FoxO1组).培养系膜细胞(RMCs)72h后,用流式细胞仪检测RMCs中绿色荧光蛋白(GFP)阳性率,并采用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测FoxO1的mRNA及蛋白表达情况.结果 成功构建LV-CA-FoxO1,其病毒滴度为1×108 TU/ml.LV-empty-FoxO1组和LV-CA-FoxO1组GFP阳性率分别为84.5%和81.4%;与NC组相比,LV-CA-FoxO1组FoxO1的mRNA与蛋白表达量相当于NC组的27.92倍与5.41倍(均P<0.05);而NC组与LV-empty-FoxO1组FoxO1的mRNA及蛋白表达量差异均无统计学意义.结论 成功构建了大鼠FoxO1基因的过表达慢病毒载体,并建立了稳定过表达FoxO1的大鼠肾小球系膜细胞株,为进一步研究FoxO1的功能和作用机制奠定了研究基础.
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