换一批
换一批真核表达载体pEGFP-N1-ASIC2a的构建及功能验证
Construction of rat pEGFP-N1-ASIC2a eukaryotic expression vector and its functional verification
摘要目的 构建含大鼠ASIC2a全长互补脱氧核糖核酸(cDNA)的绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-ASIC2a并转染至HEK293细胞,观察其表达和分布情况.方法 设计、合成ASIC2a基因引物,利用聚合酶链反应(PCR)技术,以现有质粒pcDNA3.1-ASIC2a为模板扩增出含有限制性内切酶(XhoⅠ与EcoRⅠ)酶切位点的ASIC2a基因片段与载体pEGFP-N1酶切后连接形成重组质粒pEGFP-N1-ASIC2a,并瞬时转染至HEK293细胞中,利用细胞膜片钳方法观察其表达电流的情况.为进一步明确其亚细胞定位,将质粒EGFP-N1-ASIC2a、pDsRed-Monomer-Mem和pDsRed2-ER共同转染至HEK293细胞中.结果 PCR扩增得到正确的ASIC2a基因片段,酶切鉴定和测序证实获得重组质粒pEGFP-N1-ASIC2a,并将其瞬转至HEK293细胞后,成功记录到ASIC2a同聚体电流.然后利用共转染的方法观察到,pEGFP-N1-ASIC2a主要在HEK293细胞内质网表达,细胞膜表达较少.结论 重组绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-ASIC2a构建成功,且在HEK293细胞中主要表达于内质网,为下一步研究ASIC2a的功能,特别是为ASIC2a在缺血性神经元损伤中的作用及其机制的研究奠定基础.
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关键词
ASIC2a载体构建真核表达载体绿色荧光蛋白ASIC2avector constructioneukaryotic expression vectorgreen fluorescent protein
分类号
Q782
栏目名称
基础研究·论著
DOI
10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.002
发布时间
2017-07-06
基金项目
国家自然科学基金
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