蓬乱蛋白2干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在hUVECs中的表达

Construction of lentivirus vector of DVL2 in hUVECs

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摘要目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(hUVECs)稳定表达.方法 ①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和测序技术鉴定载体构建是否成功;②以3质粒系统在HEK293T细胞中包装病毒,通过荧光显微镜观察计数并计算病毒滴度;以嘌呤霉素筛选稳定转染的hUVECs,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率.将感染好的细胞分为BC组(hUVECs空白对照)、NC组(HBLV-GFP-PURO阴性对照)、干扰组(pHB-shRNA-HDVL2)及过表达组(pHBLV-HDVL2).③通过qRT-PCR与Western blotting检测分别从mRNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平.结果 ①插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致.干扰序列峰形图为单峰,无突变.②病毒包装后,NC组、干扰组、过表达组滴度分别为2×108、2×108和1×108 TU/ml,感染人脐静脉内皮细胞的感染效率达98％.③干扰组DVL2的表达较BC组降低,差异有统计学意义(P<0.05),过表达组较BC组升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中干扰效率为61％,蛋白质过表达水平为BC组的2.7倍.结论 DVL2基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在原代hUVECs中稳定表达.