全身亚低温联合人脐带血间充质干细胞移植改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后认知障碍和能量衰竭的机制研究

Mechanism of mild whole-body hypothermia combined with human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell trans-plantation in ameliorating cognitive impairment and energy failure after hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats

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摘要目的探究全身亚低温联合人脐带血间充质干细胞(hCMNCs)移植改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后认知障碍和能量衰竭的机制.方法 7日龄新生SD乳鼠330只.随机分为11组,每组30只.空白对照组(A组)、HIBD常温组(B组)、HIBD亚低温持续72 h组(C组)、HIBD亚低温24 h干细胞移植组(D组)、HIBD亚低温48 h干细胞移植组(E组)、HIBD亚低温72 h移植组(F组)、HIBD亚低温24 h后持续3 d移植干细胞(G组)、HIBD 24 h干细胞移植组(H组)、HIBD 48 h干细胞移植组(I组)、HIBD 72 h干细胞移植组(J组)、HIBD 24 h、48 h、72 h干细胞移植组(K组).乳鼠生长的第10天、第21天和第35天对其进行称重;通过Morris水迷宫实验检测乳鼠学习和记忆能力,超微电镜观察分析乳鼠脑组织神经元细胞及突触超微结构的变化,苏木精-伊红(HE)染色观察脑组织病理学变化,酶联免疫吸附试验检测乳鼠脑组织炎症因子和干细胞分化标记蛋白含量,免疫荧光染色检测脐带CD24和CD29阳性表达率,荧光显微镜测量线粒体膜电位.结果 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K组乳鼠生长第10天、第21天和第35天体重比较,采用重复测量设计的方差分析,结果:①不同时间点乳鼠体重有差异(F=13.285,P=0.000),各组乳鼠第21天与第35天体重比较,差异有统计学意义(P<0.05);②各组乳鼠体重有差异(F=20.097,P=0.000),B组乳鼠体重较A组降低(P<0.05),C～K组乳鼠体重较B组升高(P<0.05),G、I组乳鼠体重较B、C、D、E、F、H、J、K组均升高(P<0.05),且G组与I组乳鼠体重比较,差异无统计学意义(P>0.05);③各组乳鼠体重变化趋势有差异(F=28.712,P=0.000).C～F组3种反射(悬崖调转反射、阴性趋地性、步态反射)时间较A组延长(P<0.05),但较B组缩短(P<0.05);C组3种反射时间较A、D～J组延长(P<0.05);G～K组3种反射时间与A组比较,差异无统计学意义(P>0.05);C～F组3种反射时间较G～K组延长(P<0.05).HE染色结果显示,与A组比较,B～K组乳鼠HIBD模型复制成功后第3天,脑间质水肿,小血管间隙增宽,左侧大脑出现大片坏死,细胞溶解、破坏、消失;皮质海马神经元排列紊乱,核固缩、崩解,细胞浓染,并见小胶质细胞.第21天,B～K组与A组有差异,B～K组脑组织见不同程度的损伤,其中B组可见大的梗塞灶及液化空洞形成.C～K组表现为部分炎症细胞;B组与C～K组比较,脑损伤程度较大.其中G、J、K组脑损伤及炎症程度较C～F、H、I组小.B～K组逃避潜伏期较A组延长(P<0.05),G、J、K组逃避潜伏期较B～F、H组缩短(P<0.05).B～K组神经元致密区长度较A组变短(P<0.05),厚度较A组变薄(P<0.05),而突触间隙宽度较A组变厚(P<0.05).C～K组乳鼠神经元致密区长度较B组变长(P<0.05),厚度较B组变厚(P<0.05),突触间隙宽度较B组变薄(P<0.05).G～J组乳鼠神经元致密区长度较D～F、K组变长(P<0.05),厚度较D～F、K组变厚(P<0.05),突触间隙宽度较D～F、K组变薄(P<0.05).A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K组乳鼠HIBD模型复制成功后第3天、第8天、第12天的TNF-α、IL-6、Nestin、TUBB、MBP比较,采用重复测量设计的方差分析,结果:①不同时间点TNF-α、IL-6、Nestin、TUBB、MBP有差异(F=39.451、19.754、36.957、16.794和16.958,均P=0.000);②各组乳鼠TNF-α、IL-6、Nestin、TUBB、MBP有差异(F=10.719、10.159、43.271、5.947和11.217,P=0.000、0.000、0.000、0.012和0.000);B～K组TNF-α、IL-6在HIBD模型复制成功第3天、第8天和第12天较A组升高(P<0.05),C～K组TNF-α、IL-6较B组降低(P<0.05).C～K组Nestin、TUBB和MBP较B组升高(P<0.05).③各组乳鼠TNF-α、IL-6、Nestin、TUBB、MBP变化趋势有差异(F=22.678、25.483、6.597、20.159和20.154,P=0.000、0.000、0.003、0.000和0.000).A～C组CD24和CD29阳性表达率较E～K组降低(P<0.05),G、I组较H、J、K组CD24和CD29阳性表达率升高(P<0.05).B～K组线粒体膜电位较A组降低(P<0.05),C～K组线粒体膜电位较B组升高(P<0.05),G～J组线粒体膜电位较C～F组升高(P<0.05).结论亚低温联合UCMSCs能改善HIBD乳鼠认知障碍和能量衰竭,对脑神经有保护作用.