摘要[目的]构建并表达大肠杆菌FliC蛋白D0/D1结构域与 Pal蛋白的融合蛋白,为开发新型禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)疫苗提供研究基础.[方法]分析GenBank数据库中大肠杆菌O1血清型菌株的FliC及Pal蛋白氨基酸序列特征,选择FliC蛋白的D0/D1结构域(N-端5-140位氨基酸和C-端499-583位氨基酸)及Pal蛋白主要结构(21-173位氨基酸)构建"三明治型"融合蛋白.对融合蛋白进行理化性质、二级结构、三级结构、抗原性、致敏性及线性和不连续表位预测.通过分子对接和免疫模拟分别评估融合蛋白与免疫受体的结合能力及免疫效果.合成融合蛋白碱基序列并使用pET-28a(+)进行载体构建,采用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行融合蛋白表达,利用镍-琼脂糖凝胶6FF纯化融合蛋白并进行复性,通过Western blotting验证融合蛋白的反应原性.[结果]融合蛋白分子质量为42.72 ku,是亲水蛋白;a-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占48.79％、14.25％、6.76％和30.19％,其中a-螺旋主要处于FliC蛋白D0/D1结构域;三级结构拉氏图显示,优势区域中含有的残基数占96.9％.该融合蛋白具有良好的抗原性,无致敏性,含有8个线性表位和5个不连续表位.该融合蛋白与Toll样受体2、4、5均能进行分子对接,且免疫模拟结果显示,该蛋白能引起良好的体液免疫和细胞免疫.经PCR鉴定和测序确定嵌合基因FliCN-Pal-FliCC阳性单克隆并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功表达纯化出融合蛋白FliCN-Pal-FliCC.融合蛋白能与大肠杆菌O1血清型阳性小鼠的血清发生反应.[结论]本研究成功构建并表达了以APEC O1血清型的FliC和Pal蛋白为基础的"三明治"型融合蛋白FliCN-Pal-FliCC,为研发APEC疫苗候选抗原提供研究基础.