换一批
换一批摘要目的:在甲醇营养型酵母(Pichia)表达系统中表达重组人破骨细胞形成抑制因子(Osteoclastogenesis Inhibitory factor,OCIF)结构域D1~D6基因.方法:利用PCR从本实验室构建的pProEX-OCIF上扩增得到N末端融合有6×His标签和rTEV蛋白酶识别序列的OCIF D1~D6结构域编码基因片段(OCIFm),将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌TOP10,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-OCIFm双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIFm基因片段,将其定向插入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9中,电穿孔转化酵母宿主菌GS115.筛选得到阳性表达菌株后,甲醇诱导表达5d,SDS-PAGE和Western blot对表达情况进行分析和确认,利用Ni-NTA树脂对表达产物进行一步亲和层析纯化.利用纯化产物对体外诱导培养的破骨细胞样细胞形成的抑制鉴定其活性.结果:所获得的OCIFm基因片段在甲醇酵母中表达量占菌体总蛋白的30﹪以上.Western Blot证实了表达产物的正确.初步测定了表达产物的生物学活性.结论:已成功获得了人OCIFm基因片段在甲醇酵母中的表达,表达产物的生物学活性较利用原核表达系统明显提高.
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