实时荧光定量PCR法检测MTX对映体耐药A549细胞株及白血病患者FPGS的mRNA表达-论文-万方医学网

实时荧光定量PCR法检测MTX对映体耐药A549细胞株及白血病患者FPGS的mRNA表达

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摘要目的：建立一种实时荧光定量PCR方法检测肿瘤细胞中叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)的mRNA表达，研究甲氨蝶呤(MTX)对映体(L-(+)-MTX和D-(-)-MTX)耐药细胞株中FPGS的基因表达差异，并用于临床观察白血病患者MTX治疗耐药前后FPGS的tuRNA表达水平变化。方法：用SYBR Green I为荧光染料，以β-actin作参照，建立检测FPGS mRNA的实时荧光定量方法；根据循环阈值(Ct值)、标准曲线相关系数、斜率、重复性曲线、熔解曲线、扩增效率曲线等进行方法学评价；并用该方法检测MTX对映体耐药细胞株及应用MTX耐药的白血病骨髓细胞中FPGS基因表达。结果：建立的标准曲线Ct值与模板浓度有良好的线性关系，FPGS和β-actin标准曲线相关系数分别为0.9968和0.9987，斜率分别为-3.595和-3.740，批内变异系数(CV)为1.27%～2.95，批间CV为3.82%，熔解曲线均呈单个特异峰，扩增效率相似(斜率为0.0217)；L-(+)MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞中FPGS相对含量分别为A549亲本细胞的3.51±0.66倍和0.16±0.01倍，两组间差异具有统计学意义(P<0.01,q=9.29).白血病患者应用MTX耐药后FPGS相对含量是用前的0.35±0.04倍，两组间差异具有统计学意义(P<0.01,t=8.83)。结论：建立的实时荧光定量PCR检测FPGS mRNA的方法重复性好、特异度高、稳定性好、简单易行且成本低廉，可用于FPGS基因含量分析：MTX诱导耐药后细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS基因表达发生了变化且在两种对映体细胞株间具有手性差异。