利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因及其在沙门氏菌感染过程中的功能研究-论文-万方医学网

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因及其在沙门氏菌感染过程中的功能研究

摘要[目的] 沙门氏菌是一种革兰氏阴性肠道杆菌,感染宿主后能够引发多种疾病.目前研究发现,沙门氏菌在感染宿主细胞时,Akt发生了磷酸化修饰.Akt,PI3K/Akt信号转导通路的核心,通过PI3K激活的Akt可以发生磷酸化修饰,抑制或延迟被感染细胞的凋亡.SopB是由沙门氏菌SPI-1编码、 Ⅲ型分泌系统分泌的具有肌醇磷脂酶活性的效应蛋白.我们利用λRed同源重组基因敲除技术构建沙门氏菌sopB基因突变株,该突变株及野生型沙门氏菌分别感染MEFs细胞,观察Akt磷酸化修饰情况,探索沙门氏菌效应蛋白SopB存感染宿主细胞过程中的作用机制,同时为沙门氏菌进一步减毒成为疫苗表达载体奠定基础.[方法] 运用PCR技术,扩增出两翼与sopB基因上下游序列同源、中间为卡那霉素抗性基因的DNA片段.经电转化,将外源DNA片段转入拥有λRed重组酶系统的沙门氏菌感受态细胞中,在λRed重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上同源区域发生重组,将sopB基因替换,通过PCR鉴定sopB基因突变株,并经Western Blot技术检测Akt磷酸化修饰情况.[结果]利用λRed同源重组系统成功敲除掉sopB基因,并经PCR鉴定确认；同时,通过Western Blot检测发现,相比较于野生型沙门氏菌,sopB基因突变株感染MEFs细胞后,Akt末出现磷酸化修饰.[结论] 利用λRed同源重组基因敲除技术获得sopB基因突变株；SopB介导了Akt磷酸化修饰.[意义]sopB基因突变株的成功构建,为沙门氏菌减毒突变改造成为能在临床应用的疫苗表达活菌载体奠定了基础.[创造性成果] 首次利用λRed同源重组系统获得沙门氏菌sopB基因突变株.