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摘要甲烷是地球碳循环的重要组成部分,是能源亦是第二号温室气体,其减排和高效利用是人类面临的问题和挑战.甲烷氧化菌,以甲烷为食,在碳循环中负责消耗甲烷,在甲烷的减排和高效利用方面有重要价值.甲烷氧化酶sMMO(soluble methane monooxygenase),存在于一些甲烷氧化菌中,负责催化甲烷生成甲醇—甲烷同化的起始步骤亦是最重要步骤.甲烷氧化酶有两种,颗粒型甲烷氧化酶pMMO(particulate methane monooxygenase)和可溶性甲烷氧化酶sMMO,前者定位于内膜上,后者分散于细胞质中.相对于pMMO,sMMO更加稳定、底物谱更广、在生物技术方面更有应用潜力,所以对其的研究更为深入.来自不同菌株的sMMO基因簇涉及8个保守基因mmoXYBZDCGR.其中,mmoXYBZC是sMMO的结构基因,mmoR被初步证明参与sMMO基因簇的转录调控,但机理不清.MmoR被预测为σ54依赖型转录因子,且sMMO基因簇的启动子PsMMO具有σ54依赖型启动子的典型特征,这些信息表明mmoR可能直接调控sMMO基因簇转录,但其怎样激活PsMMO以及如何响应铜离子等问题有待进一步研究.本研究以甲烷氧化菌Methylococusburyatense 5G为研究菌株,采用基于电转化技术的方法敲除了mmoR基因.mmoR突变株在无Cu2+条件下丧失了sMMO酶活性,而回补表达mmoR基因后,该回补株则恢复了对甲烷底物的氧化活性.以上结果表明,MmoR可以调控sMMO酶活性.通过启动子表达水平检测和qPCR进一步证实了MmoR是在转录水平上调节了sMMO的活性.对sMMO基因簇启动子分析发现,其转录位点位于翻译起始位点-80bp处.通过凝胶阻滞电泳证实MmoR蛋白可以在体外直接结合于sMMO启动子区域.通过基因敲除实验,转录水平分析还证实sMMO基因簇的表达需要rpoN因子的参与.在bEBP蛋白作用于目标基因启动子的过程中,往往还需要宿主整合因子(IHF)的参与.在M.buryatense基因组中也存在有IHF的两种亚基基因,himA和himD.利用pET28a表达载体在大肠杆菌中成功获得了M.buryatenseIHF的体外表达蛋白,EMSA实验显示纯化的IHF蛋白可以结合sMMO启动子的-285bp—1bp区域片段.本实验首次证实了甲烷氧化菌中sMMO酶表达受MmoR蛋白的直接调控,并且需要RpoN,IHF因子的共同参与.