换一批甘蓝型油菜BnKCR2基因cDNA的克隆和真核表达载体的构建
cDNA Cloning and Eukaryotic Expression Vector Construction of BnKCR2 Gene in Brassica napus L.
摘要[目的]为了克隆甘蓝型油菜的BnKCR2基因,并构建其真核表达载体,以期得到高芥酸含量的油菜.[方法]根据GenBank中甘蓝型油菜3-酮酯酰-CoA还原酶(BnKCR2)的cDNA序列设计引物,提取蜀杂九号油菜叶片的总RNA,进行RT-PCR扩增,将产物与TA克隆载体pMD18-T连接,通过中间载体pMD18-T和pBluescript将BnKCR2分别正向、反向导入pBI121质粒载体,构建BnKCR2基因的正向和反向表达质粒.[结果]通过甘蓝型油菜总RNA的RT-PCR扩增,成功克隆到一个960 bp的BnKCR2基因;重组质粒pMD18-BnKCR2测序结果与NCBI中甘蓝型油菜cDNA(AY196197)序列的相似性达99%;而蛋白质序列仅有1个氨基酸之差,且蛋白质天然构象未改变,BnKCR2是反向连接克隆.[结论]通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌,为通过根癌农杆菌介导法将BnKCR2基因导入油菜奠定了基础.
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