单核细胞增生李斯特菌LAMP检测方法的建立及应用

Development of a Loop-mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of Listeria monocytogenes

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摘要[目的]建立一种单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对其检测敏感性、特异性进行评价.[方法]针对单增李斯特菌的actA基因序列,设计6 条LAMP特异性引物,通过对LAMP反应体系中的反应温度、内外引物浓度比、镁离子浓度等各参数进行优化,确定最优反应体系.以单增李斯特菌株CMCC54006 株为阳性对照,其他菌株为阴性对照,验证LAMP检测方法的特异性.将纯培养的单增李斯特菌菌液提取DNA后 10 倍梯度稀释为模板进行LAMP检测,以测定该检测方法灵敏度.[结果]建立了特异性检测单增李斯特菌的LAMP检测方法,优化后确定了检测体系中FIP/BIP与F3/B3 的终浓度比为1.6∶0.2,镁离子浓度为6 mmol/L,dNTPs浓度为1.6 mmol/L,反应温度为65℃.特异性检测结果显示,仅单增李斯特菌反应管中的反应液呈绿色,表明建立的检测方法具有较高特异性.以单增李斯特菌DNA为模板进行的LAMP检测结果显示,LAMP检测方法灵敏度为64 copies/mL.[结论]建立单增李斯特菌的LAMP检测方法,高效特异,灵敏度高,可直接观察检测结果,适合现场检测.