人源pEGFP-C1-p38γ真核表达质粒的构建及其功能研究

Construction of eukaryotic expression of human derived pEGFP-C1-p38γ plasmids and its function research

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摘要目的构建人源pEGFP-C1-p38γ表达质粒,并观察其对乙醇刺激的L0-2肝细胞的增殖和凋亡及炎症因子分泌的影响.方法在人源L0-2肝细胞中提取RNA并且逆转录为cDNA,同时将引物稀释到10μmol/L,其余作为储液备用.采用PCR技术扩增p38γ并鉴定,使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行PCR产物的纯化回收,再对PCR产物及载体进行酶切回收,酶切片段连接后,进行连接产物的转化、挑菌、摇菌、质粒小抽.酶切鉴定后,进行测序鉴定.将构建好的质粒转染至乙醇刺激的人源L0-2细胞中,通过MTT实验和流式细胞术检测对其增殖和凋亡的影响,并用Western blot技术检测炎症因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在L0-2肝细胞中的表达.结果测序显示pEGFP-C1-p38γ真核表达质粒构建成功.同时,MTT实验显示,乙醇刺激L0-2细胞24 h后p38γ过表达组细胞的增殖率为(0.42±0.08)％,低于转染空载体的对照组(0.60±0.03)％;流式细胞术检测结果显示,p38γ过表达组细胞的凋亡率为(17.46±1.52)％,高于转染空载体质粒的对照组(13.18±1.34)％;Western blot检测显示p38γ过表达组中的IL-6和TNF-α表达较对照组升高.结论 p38γ能够抑制乙醇刺激的L0-2肝细胞的增殖,并促进其凋亡.同时,p38γ能够促进乙醇刺激后的L0-2肝细胞中IL-6和TNF-α的表达.