系列腺病毒伴随病毒载体的构建及表达β-半乳糖苷酶的研究

Construction of a Series of Adeno-associated Virus Vectors and Their Expression of β-galactosidase Gene

摘要为了便于开展用重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)载体进行基因治疗的研究,构建了三种通用型AAV载体pWAV-1、pWAV-2和pSNAV,每种载体均含有AAV-2两端的倒转末端重复序列(inverted terminal repeats,ITR),中间依次为巨细胞病毒(CMV)立早增强子和启动子、多克隆位点和polyA信号.研究者只需将目的基因正向插入多克隆位点,即可获得具有完整表达盒的AAV载体质粒.pWAV-1的多克隆位点包括NheⅠ、XhoⅠ、PstⅠ和BamHⅠ,可插入外源基因的最大容量为3.3kb;pWAV-2的多克隆位点为KpnⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ;pSNAV的多克隆位点为KpnⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ和BglⅡ,二者所能装载的外源基因容量均为3.6kb.同时,还构建了携带β-半乳糖苷酶基因的AAV载体pAV-lacZ、pSNAV-lacZ,并对制备rAAV的常规方法--共转染法进行了改进.用先前报道的具有rAAV包装功能的一种重组单纯疱疹病毒(recombinant herpes simplex virus,rHSV)分别感染经pAV-lacZ、pSNAV-lacZ转染的BHK-21细胞,可获得携带β-半乳糖苷酶基因的rAAV,滴度达到5×104转导单位(TU)/ml,为实现"一种病毒感染一个载体细胞株"的rAAV生产策略提供了可能.