换一批灵芝外泌体样纳米囊泡的提取鉴定及小RNA表达
Isolation,Characterization,and Small RNA Profiling of Ganoderma lucidum Exosome-like Nanovesicles
摘要目的 建立灵芝外泌体样纳米囊泡(exosome-like nanovesicles,ELNVs)提取及鉴定方法,探讨灵芝ELNVs中小RNA(small RNA,sRNA)的种类与功能.方法 应用差速离心法及外泌体提取试剂盒提取、纯化新鲜灵芝ELNVs;应用透射电镜观察ELNVs形态,利用NTA粒径分析技术测量ELNVs粒径;利用NextSeq CN500 测序平台测序sRNA文库;应用生物信息学分析ELNVs sRNA表达水平,预测潜在靶基因,进行GO和KEGG分析,探讨靶基因潜在功能.结果 透射电镜和NTA粒径分析结果证实成功提取灵芝ELNVs,电镜下呈典型茶托形态,平均粒径为208.5 nm的颗粒浓度为 1.22×1012 颗粒/mL.NextSeq CN500 测序平台分析鉴定出miRNA、piRNA和tsRNA等多种类型sRNA,其中miRNA占比对成功序列的 52.94%,为主要组分,miRNA靶基因GO生物过程分析显示与细胞周期、染色质结合能力、细胞蛋白质代谢过程、蛋白激酶结合程度及病毒-宿主相互作用等功能相关;KEGG通路分析显示,miRNA数量最多的靶基因共同富集于18 条信号通路,其中,PI3K-Akt信号通路的富集具有统计学意义(P<0.05).此外,有11 条通路表现出显著富集(P<0.01),包括细胞周期、Rap1 信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控、脂质与动脉粥样硬化、Ras信号通路等;6 条miRNA靶基因在淋巴瘤通路中表现出极显著富集(P<0.001).结论 提取并确认了灵芝ELNVs的存在,共检测出9155101 条纯净sRNA序列,长度多为18～24 nt;20 种sRNA表达量超过500 TPM;tsRNA表达量突出;GO生物过程分析显示,检测出的miRNA参与细胞周期调节、染色质结合等功能;KEGG分析显示,miRNA靶基因富集于淋巴瘤、细胞周期调控等通路.研究结果证实了灵芝ELNVs中sRNA的功能及其药理学潜力.
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