乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因载体的构建及表达

Construction and expression of secreting type human TRAIL gene vector mediated by hypoxia/radiation double sensitive promoter

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摘要目的:构建乏氧(HRE)/辐射(Egr1)双敏感启动子介导的分泌型人TRAIL(shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察乏氧和辐射对其表达的影响.方法:利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;pMD19T-Egr1经Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切得到Egr1;pshuttle-shTRAIL经Kpn Ⅰ和BarnH Ⅰ双酶切得到shTRAIL;利用基因重组技术构建含有HRE/Egrl双敏感启动子介导shTRAIL 的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确.肺腺癌A549细胞分为正常组、乏氧组(1%)、照射组(6 Gy)和乏氧加照射组;表达载体转染肺腺癌A549细胞,RT-PCR及ELISA法检测shTRAIL的表达.结果:BamH Ⅰ和Sma Ⅰ酶切,所得片段大小分别为1 284和4 998 bp、2 292和3 990 bp;以Egr1和shTRAIL引物PCR扩增该载体,得到469和820 bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确.转染肺腺癌A549细胞后,乏氧组、辐射组及乏氧加照射组shTRAIL mRNA和蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05),且乏氧加照射组表达更明显.结论:成功地构建了乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因表达的载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL;乏氧及照射能够诱导TRAIL表达增加,且二者具有协同作用.