摘要目的:制备表面表达程序性细胞死亡配体1(PD-L1)纳米抗体的细菌外膜囊泡(OMV),探讨其结构特性、细胞相容性、细胞内分布及其对程序性细胞死亡受体1(PD-1)/PD-L1信号轴的阻断效果.方法:构建pET28a-ClyA-PD-L1nb原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过超速离心法从转化PD-L1nb表达载体的BL21(DE3)单克隆菌落中分离O MV,利用组氨酸(His)标签进行蛋白纯化.采用透射电子显微镜和纳米粒径分析仪对OMV进行分析鉴定.将转化PD-L1nb表达载体的BL21(DE3)单克隆菌落所分离的OMV作为实验组,以未转化的BL21(DE3)单克隆菌落所分离的OMV作为对照组,采用Western blotting法检测2组OMV中ClyA-PD-L1nb融合蛋白表达情况,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测OMV处理后小鼠巨噬细胞RAW264.7、小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1和人胚胎肾细胞HEK293T活性,应用荧光成像技术观察OMV的肿瘤细胞内吞情况,采用流式细胞术检测PBS组、OMV-PD-L1nb组和aPD-L1+OMV-PD-L1nb组OMV与肿瘤细胞表面PD-L1的结合效果.结果:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),大肠杆菌诱导后在预计相对分子质量(约49 000)附近出现明显加粗的蛋白条带,ClyA-PD-L1nb蛋白成功表达,纯化后泳道中无明显杂蛋白存在.利用超速离心法分离得到尺寸约120 nm的OMV-PD-L1nb,透射电子显微镜下呈现为尺寸均一的圆球形结构.Western blotting法,实验组OMV中检测到ClyA-PD-L1nb特异性条带.CCK-8法,经不同浓度OMV处理后,RAW 264.7细胞、4T1细胞和HEK293T细胞活性均接近100％.荧光成像,OMV-PD-L1nb被4T1细胞内吞后分散在细胞质中.与OMV-PD-L1nb组比较,aPD-L1+OMV-PD-L1nb组细胞中平均荧光强度明显降低(P＜0.001).结论:成功制备并分离了表面表达PD-L1nb的OMV即OMV-PD-L1nb,其在小鼠巨噬细胞、肿瘤细胞和人胚胎肾细胞上显示出良好的相容性,可被肿瘤细胞内吞并成功阻断PD-1/PD-L1信号通路.