换一批血管生成素1和酪氨酸激酶受体2抑制剂对内皮细胞葡萄糖转运的作用及其机制
Effect of angiopoietin 1 and tyrosine kinase receptor 2 inhibitor on glucose transportation in endothelial cells and its mechanism
摘要目的:研究血管生成素1(Ang-1)和酪氨酸激酶受体2(Tie2)抑制剂对高糖培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)葡萄糖转运的作用,并阐明其作用机制.方法:体外高糖(30 mmol·L-1)培养HUVECs,采用 0、200、500、1 000和2 000 μg·L-1 Ang-1及0、2 500、5 000和7 500 nmol·L-1 Tie2抑制剂处理细胞,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活性,筛选Ang-1和Tie2抑制剂最佳作用浓度.葡萄糖试剂盒检测Ang-1干预细胞后HUVECs上清液中葡萄糖水平.HUVECs细胞随机分为空白对照组(NG组)、高糖作用组(HG组)、HG+Tie2抑制剂组(HG+In-Tie2组)、HG+Ang-1组、HG+Ang-1+Tie2抑制剂组(HG+Ang-1+In-Tie2组)和HG+Ang-1+磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)抑制剂组(HG+Ang-1+LY294002组).5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法检测各组细胞增殖活性,恶唑黄/碘化丙啶(YO-PRO-1/PI)法检测各组细胞凋亡率,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中Ang-1和Tie2 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中Tie2、葡萄糖转运蛋白 1(GLUT1)和葡萄糖转运蛋白 4(GLUT4)蛋白表达水平及磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K和磷酸化蛋白激酶(p-AKT)/AKT比值.结果:CCK-8法检测,与0 μg·L-1 Ang-1比较,200 μg·L-1 Ang-1作用HUVECs 48 h后HUVECs细胞活性明显升高(P<0.01);与0 nmol·L-1 Tie2抑制剂比较,2 500、5 000和7 500 nmol·L-1 Tie2抑制剂作用下HUVECs细胞活性明显降低(P<0.01);Ang-1和Tie2抑制剂的最佳浓度分别为200 μg·L-1 及2 500 nmol·L-1.与NG组比较,HG组HUVECs上清液中葡萄糖水平明显升高(P<0.01);与HG组比较,Ang-1组HUVECs上清液中葡萄糖水平明显降低(P<0.01).EdU法检测,与NG组比较,HG组HUVECs增殖活性明显降低(P<0.01);与HG组比较,HG+In-Tie2 组HUVECs增殖活性明显降低(P<0.01),HG+Ang-1 组HUVECs增殖活性明显升高(P<0.01);与HG+Ang-1 组比较,HG+Ang-1+In-Tie2 组和HG+Ang-1+LY294002组HUVECs增殖活性均明显降低(P<0.01).YO-PRO-1/PI法检测,与NG组比较,HG组HUVECs凋亡率明显升高(P<0.01);与HG组比较,HG+In-Tie2组HUVECs凋亡率明显升高(P<0.01),HG+Ang-1组HUVECs凋亡率明显降低(P<0.01);与HG+Ang-1组比较,HG+Ang-1+In-Tie2组和HG+Ang-1+LY294002组HUVECs凋亡率均明显升高(P<0.01).RT-qPCR法检测,与NG组比较,HG组和HG+In-Tie2组HUVECs中Ang-1和Tie2 mRNA表达水平均明显降低(P<0.01);与HG组比较,HG+In-Tie2组HUVECs中Ang-1和Tie2 mRNA表达水平均明显降低(P<0.01),HG+Ang-1组HUVECs中Ang-1和Tie2 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05);与HG+Ang-1组比较,HG+Ang-1+In-Tie2 组和 HG+Ang-1+LY294002组HUVECs中Ang-1和Tie2 mRNA表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01).Western blotting法检测,与NG组比较,HG组HUVECs中Tie2蛋白表达水平明显降低(P<0.01),GLUT1和GLUT4蛋白表达水平均明显升高(P<0.01);与HG组比较,HG+In-Tie2组HUVECs中Tie2、GLUT1和GLUT4蛋白表达水平均明显降低(P<0.01),HG+Ang-1 组HUVECs中Tie2 蛋白表达水平明显升高(P<0.01),GLUT1和GLUT4蛋白表达水平均明显降低(P<0.01);与HG+Ang-1组比较,HG+Ang-1+In-Tie2组和HG+Ang-1+LY294002组HUVECs中Tie2、GLUT1和GLUT4 蛋白表达水平均明显降低(P<0.01).与NG组比较,HG组HUVECs中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均明显升高(P<0.01);与HG组比较,HG+In-Tie2组HUVECs中 p-PI3K/PI3K 和 p-AKT/AKT比值均明显降低(P<0.01),HG+Ang-1 组HUVECs中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均明显降低(P<0.01);与HG+Ang-1组比较,HG+Ang-1+In-Tie2组和HG+Ang-1+LY294002组HUVECs中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均明显降低(P<0.01).结论:Ang-1 可下调高糖培养HUVECs中GLUT1 和GLUT4的表达,Ang-1与Tie2结合可能过PI3K/AKT信号通路下调GLUT1和GLUT4参与高糖培养HUVECs的葡萄糖转运.
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