摘要目的:探讨盐酸小檗碱(BBR)对1型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染HeLa细胞自噬的影响,并阐明其相关机制.方法:将处于对数生长期的HeLa细胞分别加入0、10、20、40、80、120和160 μmol·L-1 BBR中培养 24 h.另将HeLa细胞分为HSV-1 组(感染HSV-1)、L-BBR组(感染HSV-1后,用20 μmol·L-1 BBR处理 24 h)、M-BBR组(感染HSV-1后,用 40 μmol·L-1 BBR处理24 h)、H-BBR组(感染HSV-1后,用 80 μmol·L-1 BBR处理 24 h)和 740 Y-P组(感染HSV-1后,用 80 μmol·L-1 BBR和 10 μmol·L-1 740 Y-P处理 24 h),进行病毒感染及相应的药物处理.四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测检测不同浓度BBR处理HeLa细胞活性,空斑减数实验检测各组HeLa细胞中HSV-1 增殖能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组Hela细胞中病毒复制相关基因mRNA表达水平,免疫荧光法检测各组Hela细胞中微管相关蛋白 1轻链 3(LC3)自噬小体形成情况,流式细胞术检测各组Hela细胞凋亡率,Western blotting法检测各组Hela细胞中自噬及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白表达水平.结果:MTT法检测,与0 μmol·L-1 BBR组比较,120和160 μmol·L-1 BBR组HeLa细胞活性明显降低(P<0.05),对细胞具有一定毒性;选择20、40和80 μmol·L-1 BBR进行后续实验.空斑减数实验检测,与HSV-1组比较,L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中空斑形成单位(PFUs)明显减少(P<0.05),并呈剂量依赖性;与H-BBR组比较,740 Y-P组HeLa细胞中PFUs明显增加(P<0.05).RT-qPCR法检测,与HSV-1组比较,L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组感染细胞蛋白0(ICP0)、感染细胞蛋白22(ICP22)、感染细胞蛋白8(ICP8)、胸苷激酶(TK)、糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)mRNA表达水平均明显降低(P<0.05),并呈剂量依赖性;与H-BBR组比较,740 Y-P组HeLa细胞中ICP0、ICP22、ICP8、TK、gB和gD mRNA表达水平均明显升高(P<0.05).免疫荧光法检测,与HSV-1组比较,L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中LC3自噬小体形成数量增加;与H-BBR组比较,740 Y-P组HeLa细胞中LC3自噬小体形成数量减少.流式细胞术检测,与HSV-1 组比较,L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞凋亡率明显升高(P<0.05),并呈剂量依赖性;与H-BBR组比较,740 Y-P组HeLa细胞凋亡率明显降低(P<0.05).Western blotting法检测,与HSV-1组比较,L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中苄氯素1(Beclin-1)及B细胞淋巴瘤 2(Bcl-2)/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白(BNIP)蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高(P<0.05),并呈剂量依赖性;与H-BBR组比较,740 Y-P组HeLa细胞中Beclin-1 和BNIP蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低(P<0.05);与HSV-1组比较,L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3(Caspase-3)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),Bcl-2 蛋白表达水平明显降低(P<0.05),并呈剂量依赖性;与 H-BBR 组比较,740 Y-P组HeLa细胞中Caspase-1、Caspase-3和Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Bcl-2 蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与HSV-1组比较,L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K、磷酸化AKT(p-AKT)/AKT和磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR比值均明显降低(P<0.05),并呈剂量依赖性;与H-BBR组比较,740 Y-P组HeLa细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值均明显升高(P<0.05).结论:BBR能够促进HSV-1病毒感染HeLa细胞的自噬过程,诱导自噬依赖性凋亡,并显著抑制病毒的复制,其作用机制与调控PI3K/AKT/mTOR通路有关.