摘要目的 骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)患者具有较高的白血病转化风险,亟须探索新型治疗药物.基于网络药理学预测及分子对接验证,提出木犀草素(luteolin,LUT)可能通过靶向Akt信号通路诱导MDS细胞衰老与凋亡,并通过实验验证其作用靶点及分子机制.方法 通过整合PharmMapper、GeneCards等数据库,筛选出LUT与MDS的共同靶点.运用STRING数据库和 Cytoscape软件构建蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络图,确定关键靶点.利用DAVID数据库对共同靶点进行GO功能分类和KEGG通路富集分析.采用AutoDock软件对LUT与关键靶点进行分子对接,并通过结合能分析对接效果.随后用Gromacs进行分子动力学模拟,观察配体与受体的相互作用和构象变化.采用MUTZ-1和MOLM-13细胞作为研究模型,不同浓度LUT处理细胞24 h后,CCK-8检测细胞活力,EdU检测细胞DNA合成能力,软琼脂实验检测细胞克隆形成,透射电镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体ROS、线粒体膜电位和细胞凋亡水平,β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-Gal)染色检测细胞衰 老 情 况,RT-qPCR 检测衰老相关分泌表型因子(senescence-associated secretory phenotype factors,SASP)mRNA表达水平,Western blotting检测相关蛋白的表达水平.结果 共筛选出LUT靶点568个,MDS相关靶点2 348个,两者交集靶点228个.将交集靶点导入DAVID数据库,GO功能富集显示,生物过程富集于氧化应激响应、细胞衰老等;细胞组分富集于蛋白激酶复合物、分泌颗粒腔等;分子功能富集于蛋白激酶活性、细胞因子受体结合等.KEGG通路富集分析显示,主要富集于Akt 信号通路、细胞衰老和凋亡等.经STRING数据库和Cytoscape软件构建PPI网络图筛选出排名前十的关键靶点,分别是IL6、NFKB1、STAT3、TNF、JUN、BCL2、ALB、CASP3、Akt1和IL1B.分子对接结果显示,LUT与Akt1的结合能为-6.25 kcal/mol,具有较强的相互作用.分子动力学模拟结果显示,LUT与靶点Akt1结合稳定.体外实验结果显示,LUT能抑制MUTZ-1和MOLM-13细胞增殖,且呈剂量依赖性.LUT作用于MUTZ-1细胞24 h后的半数抑制浓度(half-maximal inhibitory concentration,IC50)为29.960 μmol/L,作用于MOLM-13细胞24 h后IC50为8.654 μmol/L.使用不同浓度LUT(MUTZ-1:0、15、30、60 μmol/L,MOLM-13:0、4、8、16 μmol/L)处理MUTZ-1和MOLM-13细胞24 h后,可明显抑制细胞DNA合成和克隆形成(P<0.01),细胞内ROS和线粒体ROS水平增加呈剂量依赖性(P<0.05),且细胞内线粒体膜电位下降呈剂量依赖性(P<0.05).透射电镜结果显示,LUT作用24 h后MUTZ-1和MOLM-13细胞中出现明显的细胞凋亡形态.不同浓度LUT作用24 h后细胞凋亡率增加,且呈现剂量依赖性(P<0.05),Cleaved PARP和Cleaved caspase-3蛋白表达显著上调,抗凋亡蛋白BCL-2表达显著下调,促凋亡蛋白BAX表达显著上调.SA-β-Gal染色显示,LUT作用24 h后MUTZ-1和MOLM-13细胞衰老比例明显增加,相关SASP表达显著升高(P<0.001),衰老相关蛋白p53、p21、p16表达显著上调,细胞p-Akt(Ser473)蛋白表达显著下调(P<0.05),总Akt蛋白无明显变化,p-MDM2(Ser166)蛋白水平显著下调(P<0.001).结论 LUT可能通过靶向Akt信号通路诱导MDS细胞发生线粒体依赖性凋亡与衰老,从而抑制MDS细胞增殖.