摘要目的 钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)被认为可能参与海马星形胶质细胞兴奋性氨基酸转运蛋白1(excitatory amino acid transporter 1,EAAT1)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(excitatory amino acid transporter 2,EAAT2)表达的调控,本研究旨在探究在红藻氨酸(kainic acid,KA)诱导的癫痫模型中他克莫司(tacrolimus,FK506)是否通过上调海马星形胶质细胞EAAT1和EAAT2的表达从而减少癫痫的发生.方法 采用来源于GEO数据库人类和小鼠脑scRNA-seq数据集GSE190453、GSE241349分析EAAT1、EAAT2、CaN、GFAP和NeuN的细胞类型分布,采用KA癫痫小鼠海马星形胶质细胞RNA-seq数据集 GSE237321分析 EAAT1、EAAT2、CaN和 GFAP表达特征.实验动物为 108只 SPF级 6～8周龄C57BL/6J小鼠(体质量19～23 g,雌雄各半).为评估低剂量的FK506对癫痫小鼠的皮层放电和EAAT1、EAAT2的调节作用,本研究首先进行低剂量的FK506干预实验,采用随机数字表法将12只小鼠分为Control组、KA组和FK506组(n=4),FK506组造模前24 h及1 h单次腹腔注射1 mg/kg的FK506,KA组向小鼠两侧海马分别注射0.5 μL KA(0.5 μg/μL)造模,KA造模48 h后评估给药对皮层放电及EAAT1、EAAT2的mRNA表达的影响.为确定EAAT1、EAAT2、CaN和GFAP的蛋白的时间表达特征以及合适的取材时间,本研究利用随机数字表法将36只小鼠分为Control组、6 h、1 d、3 d、5 d和7 d组(n=6),经KA造模后收集对应时间点的海马组织,用于Western blotting实验检测各蛋白指标的变化.为评估不同剂量的FK506的疗效,将60只小鼠分为Control组、KA组、FK506 1 mg/kg组、FK506 2 mg/kg组、FK506 4 mg/kg组(n=10),各FK506治疗组于KA造模前24 h及1 h腹腔注射对应剂量的FK506,KA造模后连续3 d 腹腔注射对应剂量的FK506.KA造模后第5天进行旷场实验以评估小鼠运动状态,实验结束后每组收集6只小鼠的海马组织,用于Western blotting实验检测各组EAAT1、EAAT2、CaN和GFAP的蛋白表达,各组其余小鼠采用 HE 染色观察海马神经元病理改变,采用免疫荧光染色法检测EAAT1、EAAT2与 GFAP 的共定位情况.结果 scRNA-seq数据分析结果显示,EAAT1、EAAT2 特异性定位于星形胶质细胞,CaN 同样在星形胶质细胞中存在表达.小鼠海马星形胶质细胞RNA-seq数据分析结果表明,相较于PBS和AAV组,KA组EAAT1、EAAT2 mRNA水平在KA诱导4 d后显著下调(P<0.01),GFAP和CaN显著上调(P<0.05).小鼠海马组织切片免疫荧光结果表明,EAAT1和EAAT2与星形胶质细胞标志物GFAP共定位,与Control组相比,KA组GFAP荧光强度显著增加(P<0.05).Western blotting结果显示,与Control组比较,5 d组EAAT1和EAAT2显著下调(P<0.01);GFAP水平在KA处理后6 h开始升高,3 d时显著增加(P<0.05);CaN全长蛋白水平自3 d起下降(P<0.01),而45 kDa CaN活性片段在3 d和5 d时显著增加.表明CaN在癫痫发生早期就已经被激活,可能参与EAAT1和EAAT2蛋白表达的调控.造模前给予1 mg/kg FK506可改善KA小鼠大脑皮层异常放电,并部分缓解KA诱导的EAAT1和EAAT2 mRNA下调(P<0.05).造模后连续给予不同剂量FK506干预可减轻海马CA1、CA3区神经元损伤及小鼠运动障碍.Western blotting显示,不同剂量FK506可抑制KA诱导的EAAT1和EAAT2表达下调(P<0.01),抑制CaN全长蛋白下调及45 kDa CaN活性片段产生(P<0.01),同时部分抑制GFAP上调(P<0.01),并显著抑制NeuN下调(P<0.05),表明不同剂量的FK506具有神经保护作用.结论 在KA诱导的癫痫小鼠模型中,FK506通过抑制CaN活性片段的产生,上调EAAT1和EAAT2的表达,从而减轻癫痫诱导的神经损伤.