摘要目的 冠状动脉微循环障碍(coronary microvascular dysfunction,CMD)在冠心病群体中患病率高,且作为独立危险因素大幅增加心血管事件风险,但缺乏靶向干预措施.钙周期蛋白(S100a6)具有调节内皮细胞周期的作用,但其在CMD中的表达特征及保护机制尚不明确.本研究旨在明确S100a6在CMD中的内源性保护作用,阐明其通过稳定β-catenin/TCF1复合体抑制PARP9/STAT1信号轴活化改善CMD的分子机制.方法 选用8周龄、体质量38～42 g的雄性ob/ob小鼠共12只,采用随机数字表法将小鼠分为CMD组与CMD-S100a6KD组(n=6).其中,CMD组小鼠经尾静脉注射scramble对照病毒,CMD-S100a6KD组小鼠经尾静脉注射内皮特异性的腺病毒以敲低S100a6的表达.另选取6只同周龄的雄性C57BL/6J野生型小鼠(体质量18～22 g)作为健康对照组(Control组),常规饲养不做任何模型构建及药物或基因干预.通过尾静脉注射内皮特异性Tie启动子驱动的AAV9-shS100a6实现S100a6内皮特异性敲低,20周后通过心脏超声检测小鼠冠状动脉血流储备(coronary flow reserve,CFR)及左心室舒张功能(E/e'),取小鼠心脏组织行免疫荧光染色检测心肌微血管密度及相关蛋白表达与定位.体外培养人冠状动脉微血管内皮细胞(human coronary microvascular endothelial cells,HCMECs),以高糖(25 mmol/L)联合游离脂肪酸(0.5 mmol/L)处理48 h构建CMD细胞模型,采用siRNA及质粒进行基因干预.根据不同实验目的分为:基线对照组[正常培养的对照组(Control组)和CMD模型组(HG组)]、S100a6功能缺失组(HG+siS100a6和HG+siNC组)及下游机制挽救组(HG+siS100a6+siPARP9及其HG+siS100a6+siNC组、HG+siS100a6+OE β-catenin及其HG+siS100a6+OE NC组).通过单细胞 RNA测序分析心脏组织S100a6的细胞亚群表达,并通过批量RNA测序筛选差异基因与富集通路;以Western blotting、RT-qPCR检测S100a6、β-catenin、TCF1、PARP9、STAT1及p-STAT1的蛋白相对表达量与mRNA表达水平;采用免疫共沉淀方法验证β-catenin与TCF1相互作用,通过染色质免疫共沉淀方法检测TCF1与PARP9启动子结合能力,明确相关分子机制.通过EdU增殖实验、划痕愈合实验及成管实验评估内皮细胞功能.结果 与CMD组比较,CMD-S100a6KD组小鼠CFR显著降低(P<0.05),E/e'比值显著升高(P<0.05),心肌微血管密度显著降低(P<0.05).单细胞RNA测序结果显示,CMD组小鼠心脏组织中S100a6整体表达显著升高,且在心脏内皮细胞亚群中显著升高(P<0.05);免疫荧光共定位分析显示S100a6与CD31的共定位信号明显增强(P<0.000 1).体外实验中,高糖高脂刺激使HCMECs S100a6蛋白表达水平显著高于正常培养的对照组(P<0.05).S100a6敲低导致HCMECs成管分支数显著减少(P<0.05)、划痕愈合率显著降低(P<0.05)及EdU阳性率显著降低(P<0.05).批量RNA测序结果显示S100a6敲低后PARP9基因表达显著上调,基因富集分析显示STAT1信号通路显著富集;在敲低S100a6的同时敲低PARP9,STAT1磷酸化水平较单纯S100a6敲低组显著降低(P<0.000 1);功能学实验证实沉默PARP9显著改善了S100a6敲低引起的HCMECs成管功能障碍(P<0.05)、迁移能力受损(P<0.05)及EdU阳性率降低(P<0.05).分子对接实验显示S100a6结合在TCF1和β-catenin的结合界面缝隙中;敲低S100a6使β-catenin蛋白水平显著降低(P<0.05),β-catenin与TCF1的相互作用显著减弱(P<0.05),TCF1与PARP9启动子区域的结合显著减少(P<0.05).在敲低S100a6的同时过表达β-catenin使PARP9蛋白表达水平显著降低(P<0.05),磷酸化STAT1水平显著下降(P<0.05);功能学层面,β-catenin过表达显著改善了S100a6缺失导致的HCMECs成管分支数减少(P<0.05)、划痕愈合率降低(P<0.05)及EdU阳性率降低(P<0.05).结论 S100a6是冠状动脉微循环障碍的内源性保护因子,其通过β-catenin/TCF1复合体依赖性转录抑制调控PARP9/STAT1信号通路的活化,维持内皮细胞稳态,进而改善冠状动脉微循环障碍.