摘要目的 为明确NRF2对成纤维细胞增殖与迁移的作用,本研究拟探讨在低剂量5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)下,转录因子核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)是否通过调控巨噬细胞向M2型极化促进成纤维细胞的增殖与迁移,从而加速组织修复进程.方法 本研究以人单核细胞白血病细胞系(tamn-horsfall protein 1,THP-1)为研究对象,采用随机数字表法将其分为4组:①对照组:使用100 ng/mL佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)溶液诱导THP-1 48 h,使其分化为M0型巨噬细胞后正常培养不接受其他处理;②ALA组:避光条件下使用0.1 mmol/L ALA溶液孵育M0型巨噬细胞2.5 h;③红光组:M0型巨噬细胞正常培养后接受50 mW/cm2红光照射30 s;④ALA-PDT组:经0.1 mmol/L ALA避光孵育M0型巨噬细胞2.5 h后,接受50 mW/cm2红光照射30 s.为验证NRF2的核心作用,另设NRF2-IN-1干预组,即在ALA-PDT处理前加入10 μmol/L NRF2特异性抑制剂NRF2-IN-1预处理10 h.实验检测指标包括:采用免疫荧光染色观察巨噬细胞M2型标志物CD206的蛋白定位与表达强度;通过Western blotting定量分析各组巨噬细胞标志物ARG-1、INOS以及NRF2、HO-1的表达水平;应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中抗炎因子及促修复因子IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β及VEGF的分泌浓度.随后,将各组巨噬细胞的条件培养基与成纤维细胞进行间接共培养,利用CCK-8法检测成纤维细胞在24 h的增殖活性,并通过细胞划痕实验定量分析成纤维细胞在0、24 h的迁移率.结果 实验结果显示,与对照组、ALA组及红光组相比,ALA-PDT组巨噬细胞的NRF2蛋白表达水平显著上调(总NRF2相对表达量约为对照组的3.6倍,P<0.001),并诱导了明显的M2型极化,表现为CD206荧光强度增强(相对荧光强度约为2.5,P<0.001)、ARG-1表达水平升高(相对表达量约为 4.0,P<0.000 1)及上清液中 IL-4(约 260 pg/mL,P<0.05)、IL-10(约45 pg/mL,P<0.01)、IL-13(约75 pg/mL,P<0.001)、TGF-β(约30 pg/mL,P<0.01)及VEGF(约70 pg/mL,P<0.000 1)的分泌量显著升高.在与ALA-PDT组巨噬细胞条件培养基共培养后,成纤维细胞的增殖活性(细胞存活率约为1.7,P<0.05)与迁移率(迁移率约为0.21,P<0.05)均得到显著促进.然而,在使用NRF2抑制剂NRF2-IN-1干预后,上述效应被显著逆转:ALA-PDT组的NRF2(总NRF2相对表达量降至约2.5,P<0.01)、HO-1(相对表达量降至约2.2,P<0.01)表达被抑制,CD206表达减 弱(相对荧光强度降至约1.8,P<0.05),IL-4(降至约17 pg/mL,P<0.05)、IL-10(降至约35 pg/mL,P<0.05)、IL-13(降至约24 pg/mL,P<0.05)、TGF-β(降至约22 pg/mL,P<0.05)及VEGF(降至约50 pg/mL,P<0.01)的分泌水平降低.相应地,经抑制剂处理的ALA-PDT组巨噬细胞条件培养基,其促进成纤维细胞增殖(细胞存活率降至约 1.0,P<0.05)与迁移(迁移率降至约 0.3,P<0.05)的能力也显著削弱.结论 低剂量ALA-PDT可通过激活巨噬细胞内的NRF2/HO-1信号通路,诱导其向M2型抗炎表型极化,并增加抗炎因子与促修复因子的分泌,进而通过旁分泌机制显著促进成纤维细胞的增殖与迁移能力,本研究为临床利用低剂量PDT策略治疗难愈性创面提供了重要的理论依据与潜在的分子靶点.