换一批人EGFR显性负性突变体真核表达载体的构建、蛋白表达及亚细胞结构定位
Construction of the eukaryotic vector carrying human dominant negative epidermal growth factor receptor,its expression and sub-cellular localization in COS-7 cells
摘要目的:构建人EGFR显性负性突变体真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR,转染COS-7细胞,检测DNEGFR-EGFP的表达并进行亚细胞结构定位.方法:将RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法扩增得到编码EGFR信号肽段、胞外区和跨膜区的cDNA,定向克隆至空载体pEGFP-N1中,构建真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR.经PCR扩增鉴定、双酶切鉴定、核苷酸序列测定以及生物信息学分析证明pEGFPN1-DNEGFR构建成功后,脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,Western Blot检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,应用光谱激光扫描共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测.结果:PCR扩增鉴定、双酶切鉴定、核苷酸序列测定以及生物信息学分析证实pEGFPN1-DNEGFR构建成功,并且Western Blot检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,光谱激光扫描共聚焦显微镜观察显示DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜.结论:成功构建人EGFR显性负性突变体真核表达载体,并在COS-7细胞胞膜上表达,为靶向EGFR显性负性策略在肿瘤基因治疗中的进一步研究打下基础.
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关键词
表皮生长因子受体显性负性突变体单核苷酸多态性定向克隆亚细胞结构定位epidermal growth factor receptordominant negative mutantsingle nucleotide polymorphismdirectional cloningsub-cellular localization
栏目名称
DOI
10.3321/j.issn:1000-2790.2009.21.002
发布时间
2010-05-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（30972872）
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