换一批
换一批靶向SynDIG1的shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定
Construction of shRNA Lentivirus Vectors Targeting SynDIG1 and Functionl Identification
摘要为了构建靶向突触分化诱导基因1(SynDIG1)的shRNA慢病毒表达载体,设计出SynDIG1的siRNA的靶点序列,并合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,合成的Oligo经过退火分别与双酶切处理后的pLKO.1-GFP载体连接.将构建的重组质粒pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA转化到DH5a感受态细菌中,过夜培养后挑选阳性克隆子,扩增后提取DNA进行质粒测序,得到两个序列正确的重组质粒.用这些重组质粒转染HEK293T细胞以及大鼠海马神经元细胞,蛋白免疫印迹及细胞免疫荧光检测SynDIGl shRNA对外源性和内源性SynDIG1表达的敲减作用.进一步用重组质粒转染HEK293T细胞产生慢病毒颗粒,用病毒颗粒感染DIV2和DIV14的神经细胞,免疫印迹检测SynDIGl的表达.结果表明这两个重组质粒均能够有效地抑制外源性和内源性SynDIG1的表达,对HEK293T中瞬时表达的SynDIG1敲减率达到75％,其慢病毒颗粒感染对早期神经细胞中内源性SynDIG1的表达抑制也很明显.用pLKO.1-GFP成功构建了能够有效抑制外源性和内源性SynDIG1表达的重组质粒,为探讨RNA干扰技术抑制神经细胞SynDIGl基因表达的相关研究奠定基础,为研究SynDIG1基因在神经传导和突触发育及其可塑性调节中的作用提供了有力工具.
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