换一批
换一批十二指肠贾第虫谷氨酸脱氢酶原核表达及动力学分析
Prokaryotic Expression and Dynamic Analysis of Glutamate Dehydrogenase in Giardiaduodenalis
摘要为探索十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)在滋养体中的分布和酶动力学等生物学特性,对GDH进行了克隆并构建原核表达质粒pET-28a-GDH,然后转化至BL21(DE3)plysS感受态细胞中经IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,以Ni2+亲和层析纯化.对纯化的重组GDH进行体外酶动力学分析并免疫小鼠制备多克隆抗体,最后用间接免疫荧光技术对滋养体中的GDH进行定位.结果显示,贾第虫GDH的编码序列长1350 bp,试验成功构建pET-28a-GDH重组表达质粒并诱导表达,重组蛋白约为49.7 ku,且大部分以可溶性形式存在.ELISA和Western blot结果表明,贾第虫GDH具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体具有较强特异性.间接免疫荧光定位显示GDH主要位于滋养体的胞质中.酶动力学研究结果显示,GDH最适反应pH约为9.3、最适温度约为42℃,对L-谷氨酸和NADP+的Km值分别为4.485 mmol/L±0.5062 mmol/L和119.5μmol/L±10.1μmol/L.研究结果为深入研究贾第虫GDH的生物学功能奠定了基础.
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