换一批猪肺炎支原体重组蛋白p46真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
Eukaryotic Expression of Recombinant Protein P46 of Mycoplasma hyopneumoniae and Establishmentof Indirect ELISA Antibody Detection Method
摘要为了建立一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,构建pCAGGS-P46真核表达载体,转染至HEK293F细胞中进行真核表达,纯化后采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子质量大小,经 Western blot检测重组p46蛋白特异性和反应原性.以重组蛋白p46为包被抗原,优化反应条件,确定阴性、阳性临界值,建立猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,并对方法的敏感性、稳定性、特异性进行评价.结果显示,p46重组蛋白分子质量大小为48.0 ku,纯度在90％以上,特异性和反应性良好.建立的间接ELISA检测方法最优检测条件为:抗原包被浓度为5 μg/mL,采用本实验室封闭液37 ℃封闭120 min,待检血清1∶50稀释,37 ℃孵育30 min,二抗稀释度为1∶10 000,37 ℃孵育30 min,TMB室温显色20 min.结果判定标准为:OD450＞0.288 7为阳性,OD450＜0.248 7为阴性,0.248 7≤OD450 ≤0.288 7为可疑.建立的基于猪肺炎支原体p46蛋白的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性,与IDEXX的间接ELISA检测试剂盒检测的阴性、阳性血清符合率分别为100％、93.3％,研究结果为猪肺炎支原体抗体检测和免疫评价提供了技术支持.
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栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.1007-5038.2025.06.013
发布时间
2025-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
河南省自然科学基金项目（222300420467）
河南省重大科技专项项目（221100110600-03）
国家生猪产业技术体系项目（CARS-35）
河南省生猪产业技术体系项目（HARS-22-12-S）
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