摘要本研究以猪耳缘成纤维细胞(PEMFs)为模型,评估环黄芪醇(CAG)对PEMFs冷冻损伤的保护作用及分子机制.试验利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定CAG对复苏后第3代(P3)、第6代(P6)和第9代(P9)PEMFs增殖活力的影响,以GraphPad Prism 9.5软件中的非线性回归方法(Hill模型)计算CAG的半数效应浓度(EC50);通过流式细胞术检测线粒体膜电位以及活性氧(ROS)和线粒体超氧化物水平;结合蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色和透射电镜结果,解析磷酸酶和张力蛋白同源物诱导激酶1(PINK1)-Parkin通路及自噬标志物轻链3B(LC3B)和p62的表达变化;通过p62抑制剂PTX80和Nrf2抑制剂ML385处理细胞,再次测定细胞ROS和线粒体超氧化物水平,验证p62-Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)-核因子E2相关因子2(Nrf2)-还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)醌氧化还原酶1(NQO1)级联反应的关键性;最后通过转录组测序进一步探究CAG调控的基因网络及富集通路.结果表明:CAG极显著提高PEMFs的线粒体膜电位(P＜0.01),极显著降低ROS和线粒体超氧化物水平以及DNA损伤(P＜0.01);虽然PINK1-Parkin介导的线粒体自噬通路受阻,p62和LC3B蛋白表达水平均显著提高(P＜0.05),但透射电镜下自噬小体减少,细胞内p62积累促进了核内Nrf2和下游NQO1蛋白表达(P＜0.05);在p62或Nrf2特异性抑制后,PEMFs中ROS和线粒体超氧化物水平均显著提高(P＜0.05),显示p62-Keap1-Nrf2-NQO1轴在CAG抗氧化保护中的核心作用;转录组测序结果显示,差异表达基因主要富集于抗氧化反应、氧化还原酶活性、自噬调控、细胞衰老、呼吸链、线粒体结构以及DNA修复等功能通路;热图结果显示,CAG处理细胞后,细胞中超氧化物歧化酶、热休克蛋白和过氧化物酶等经典抗氧化基因显著上调,与蛋白及功能试验结果高度一致.综上所述,CAG通过激活p62-Keap1-Nrf2-NQO1信号轴维系线粒体稳态并强化抗氧化和DNA修复能力,为优化猪体细胞冷冻保存策略提供了理论依据.