换一批表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A点突变质粒的构建及在Huh7细胞中的表达
Construction of point mutation plasmids expressing HCV NS3/4A with different secondary structures at amino-terminal and their expressions in Huh 7 cells
摘要目的 构建表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A的点突变质粒,并在Huh7细胞中进行表达.方法 以pSG5/M-H05-5/4A为模板(A1-1),根据分型标准设计点突变引物.首先构建4个单点突变质粒:pSG5/M-H05-5(A1-2)/4A(A1-2)(Y56F),pSG5/M-H05-5(B1-1)/4A(B1-1)(L80Q),pSG5/M-H05-5(B2-1)/4A(B2-1)(v5IA),pSG5/M-H05-5(B2-2)/4A(B2-2)(S61A).然后,分别以A1-2,B2-1,B2-2为模板,再将第80位的赖氨酸点突变为谷氨酸(L80Q),构建另外3个双点突变质粒:pSG5/M.H05-5(B1-2)/4A(B1-2),pSG5/M-H05-5(A2-1)/4A(A2-1)和pSG5/M-H05-5(A2-2)/4A(A2-2).每个质粒均进行序列测定验证点突变成功.用FuGene 6转染试剂将构建物转染入Huh7细胞,并应用间接免疫荧光试验和Western blotting检测构建物的表达.结果 免疫荧光实验检测到NS3的4种亚细胞定位方式:点状,弥漫样,面包圈样,及短棒状.WesternBlotting亦显示构建物均成功表达,同时发现A2-1和B2-1亚型NS3/4A存在不完全切割现象.表明与其他亚型相比,A2-1和B2-1 NS3 in cis 丝氨酸蛋白酶活性较弱.结论 成功构建表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A点突变质粒,为抗不同亚型HCV的深入研究提供基础.
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分类号
R512.6（传染病）
栏目名称
DOI
10.3321/j.issn:1673-4254.2009.04.021
发布时间
2009-06-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
日中笹川医学奖学金资助项目（2006～2007）
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