换一批人源抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定
Preparation and characterization of human phage display antibody against peroxiredoxin Ⅰ of lung adenocarcinoma
摘要目的 构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗Peroxiredoxin Ⅰ(Prx Ⅰ)肺腺癌人源单链抗体.方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(V_H)和轻链可变区基因(V_L),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PeR)将V_H和V_L连接得剑单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库.PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiⅠ和NotⅠ双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxⅠ为靶抗原对抗体库进行筛选富集.将阳性克隆用IPTG诱导表达.用SDS-PAGE及Western blotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性.结果 成功构建噬菌体单链抗体库.ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带.在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集.收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍.随机选取10个克隆,通过ELISA法检测剑其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%.SDS-PAGE及Western blotting证实抗体得到可溶表达.ELISA及免疫细胞化学检测表明抗体能相对特异地与肺腺癌细胞结合.结论 成功构建肺腺癌人源噬菌体抗体库,并从中筛选得到能相对特异地与高表达Prx Ⅰ的肺腺癌细胞D549结合的单链抗体.
更多相关知识
关键词
噬菌体抗体库单链抗体Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌phage antibody librarysingle chain variable fragmentperoxiredoxin Ⅰlung adenocarcinoma
栏目名称
DOI
10.12122/j.issn.1673-4254.2010.01.006
发布时间
2010-04-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（30370422）
- 浏览300
- 被引7
- 下载1
相似文献
- 中文期刊
- 外文期刊
- 学位论文
- 会议论文
