换一批
换一批摘要目的 构建pSG5/Myc-TRIF质粒,并检验其在Huh7细胞巾的瞬时表达.方法 首先用Not Ⅰ酶切既往构建的DCX4pur/Myc-TRIF质粒,平末端化,然后用EcoR Ⅰ酶切,获得TRIF片断.用Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ先后酶切空载体pSG5.各酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析.与预期吻合后,电泳回收靶片段.行连接反应.经筛选阳性克隆,扩大培养、提取、纯化重组质粒.BamH Ⅰ酶切鉴定重组质粒pSG5/Myc-TRIF.分别用FuGene 6转染试剂和重组牛痘病毒(rVW)预感染后用Lipofectin转染重组质粒入Huh7细胞.用免疫荧光染色、Western blot检测pSG5/Myc-TRIF的表达.结果 经限制性内切酶BamH Ⅰ酶切后,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小与预期一致.转染后,荧光显微镜下可见Huh-7细胞表达Myc-TRIF蛋白,而且用rVV预感染后Lipofectin转染较用FuGene6转染表达率大大提高.Western blot结果显示在转染pSG5/Myc-TRIF的Huh7细胞中,均出现了大小约100 ku的条带.rVV预感染后用Lipofectin转染较FuGene6转染表达量高,与免疫荧光染色结果一致.结论 成功构建了pSG5/Myc-TRIF质粒.用rVV预感染Huh7细胞后再用Lipofectin转染重组质粒可以提高表达效率.
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