条件培养基抑制L-抗坏血酸钠介导的小鼠黑色素瘤细胞凋亡

Mouse melanoma cell line B16F10-derived conditioned medium inhibits sodium L-ascorbate-induced B16F10 cell apoptosis

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摘要目的探讨肿瘤细胞B16F10通过自分泌对抗由L-抗坏血酸钠(VitC Na)介导的凋亡作用.方法常规在75 cm2培养瓶中培养小鼠黑色素瘤细胞B16F10,待细胞长至90％～95％融合时吸取原DMEM/高糖培养液,用PBS反复清洗后加入无血清的DMEM/糖10ml在培养箱中培养6～8h,收集培养液用2500r/min离心5 min后上清用0.22 μm滤器过滤,-20℃保存备用,在6孔板中每孔接种1×106B16F10,常规培养24h后,实验组每孔加入2 ml条件培养液(含有10％胎牛血清),对照组用普通培养液,两组均用10 mmol/L VitC Na促凋亡,分别在3、6、24 h观察细胞凋亡情况,hoechst染核,收集细胞免疫荧光检测caspase3和TUNEL、RT-PCR检测Bcl2表达.进而分离出条件培养液中相对分子质量大于5 000和小于5 000成分,分别煮沸,用蛋白酶K灭活后对BI6F10促凋亡.结果发现条件培养基能够抑制VitC Na介导的小鼠黑色素瘤细胞B16F10凋亡,抗凋亡成分小于5 000,且不能被煮沸和蛋白酶K灭活,提示其是小分子抗凋亡物质.结论 B16F10可以分泌出拮抗细胞凋亡的小分子物质.