AP2α荧光素酶报告基因的构建及在BMPs诱导成骨分化研究中的应用

Construction of a luciferase reporter vector containing response element of activator protein 2αand its application in study of osteogenetic differentiation

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摘要目的：构建一种携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体，并应用于筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。方法设计4个串联的AP2α效应元件(AP2α-RE)，将其克隆至经Bam HⅠ和MluⅠ双酶切的pBGLuc荧光素酶报告基因质粒构建pBGLuc-AP2α-RE载体。重组腺病毒Ad-AP2α及其两种显性负性突变体Ad-dnAP2α感染小鼠间充质干细胞C3H10，通过Real-time PCR、Western blot检测AP2α的mRNA和蛋白水平表达，EMSA检测AP2α的DNA结合能力。pBGLuc-AP2α-RE转染C3H10细胞，荧光素酶报告基因检测同上各组AP2α的转录活性。Ad-BMPs感染pBGLuc-AP2α-RE转染的C3H10细胞，荧光素酶报告基因筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。结果经PCR、酶切及测序鉴定，证实AP2α-RE正确克隆至pBGLuc-AP2α-RE荧光素酶报告基因载体，Ad-AP2α感染能显著提高AP2α的表达及结合DNA的能力。显性负性突变体可以表达各自的突变体， EMSA结果显示Ad-dnAP2α-△bHLH组能显著抑制AP2α结合DNA的能力，而Ad-dnAP2α-△TAD组结合的DNA探针强于对照组。荧光素酶报告基因提示AP2α过表达组能促进AP2α转录活性，而两种显性负性突变体均能抑制AP2α转录活性。重组腺病毒BMPs感染组的AP2α转录活性均有增高，其中BMP9最为显著。结论成功构建携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体用于检测AP2α的转录活性，并初步发现BMP9对AP2α的转录活性有明显的促进作用。