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大肠杆菌O157:H7体内多聚磷酸盐的DAPI荧光定量检测

A fluorometric method for direct detection of inorganic polyphosphate in enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7

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摘要目的应用荧光剂DAPI探索一种直接定量大肠杆菌O157:H7无机多聚磷酸盐(polyP)的可靠方法.方法提取并纯化大肠杆菌O157:H7野生株DNA,DAPI与DNA、polyP45结合,测定360 nm和415 nm激发光的发射光谱;应用共聚焦显微镜,观察细菌DAPI-DNA和DAPI-polyP复合物荧光,验证DAPI检测polyP的可行性;细菌液氮速冻溶解、-80℃速冻溶解、-20℃速冻溶解、60℃加热10 min、Triton x-100作用、室温下放置后倍比稀释涂平板,观察6种方法对细菌存活的影响;与DAPI作用后,测定荧光值,确定细胞膜通透性的最佳前处理方法;建立标准曲线,测定EHEC野生株、ppk1两个突变株polyP含量.结果应用360 nm激发波长,DAPI-DNA最大发射波长为460 nm;应用415 nm激发波长,DAPI-polyP最大发射波长为550 nm;应用405 nm激发光,收集DAPI-DNA蓝色荧光(425～475 nm),应用488 nm激发光,收集DAPI-polyP绿色荧光(500～560 nm);最佳细菌前处理方法为-80℃速冻后室温下自然溶解;标准曲线为Y=1849X+127.5(R2=0.991),测定各株菌polyP量,其中野生株显著高于ppk1缺失突变株.结论 DAPI荧光定量检测方法具有直接、可靠、易于操作、定量检测等特点,可为进一步研究polyP在肠出血型大肠埃希菌O157:H7中的作用提供技术支持.

作者杜艳丽 ^[1] 韩宗利 ^[2] 王湘雨 ^[3] 万成松 ^[4] 学术成果认领

作者单位深圳职业技术学院医护学院,广东深圳,518036 ^[1] 北京大学深圳医院神经外科,广东深圳,518036 ^[2] 南方医科大学公共卫生学院 BSL-3 实验室,广东广州 510515;深圳大学第一附属医院,深圳市第二人民医院消化内科,广东深圳 518036 ^[3] 南方医科大学公共卫生学院 BSL-3 实验室,广东广州,510515 ^[4]

关键词无机多聚磷酸盐 DAPI染色大肠杆菌O157 H7

医学主题词大肠杆菌(Escherichia coli)荧光(Fluorescence)方法(Methods)细菌(Bacteria)光(Light)

栏目名称

技术方法

DOI 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.03.13

发布时间 2019-04-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

基金项目

国家自然科学基金（81371765）广东省自然科学基金（2018B030311063）广东省自然科学基金（2014A030313312）