基于核酶开关的哺乳细胞内硫胺素焦磷酸荧光生物传感器的建立

Engineering of Thiamin Pyrophosphate Fluorescent Biosensors Based on Ribozyme Switches in Mammalian Cells

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摘要硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate,TPP)是维生素B1在细胞内的主要活性形式,也是糖、脂肪酸和氨基酸氧化代谢中重要的辅助因子.在细胞内,利用TPP适配体与天然核酶组装成的人工核酶开关调节靶基因表达,目前仅局限于原核、真菌或植物细胞.本实验将原核生物中筛选的“Switch-on”与“Switch-off"的两种类型的TPP核酶开关,运用重叠延伸PCR的方法构建于增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的3'非翻译区(UTR),转染人胚肾上皮细胞(HEK293),通过荧光显微镜和流式细胞仪分析,观察了不同浓度TPP对EGFP表达能力的调控.结果表明,构建的两种“Switch-on”和一种“Switch-off”核酶开关均表现出明显的TPP浓度依赖性,且具有良好的特异性,在150 μmol/L TPP时分别将EGFP的荧光强度提高3.1倍、1.9倍和降低2.3倍.这种构建通过TPP与核酶开关中其适配体的特异性作用直接将TPP浓度的变化转化为报告基因表达的改变,利于通过荧光检测方法实现对哺乳活细胞内代谢物或因子的无标记、无损伤、可视、高效的检测.

作者 张媛媛 ^[1] 程慧 ^[2] 孙艳 ^[2] 王金娥 ^[2] 吴正岩 ^[3] 裴仁军 ^[2] 学术成果认领

作者单位 安徽医科大学生命科学学院,合肥230032 ;中国科学院合肥物质研究院,合肥230031;中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所,苏州215123 ^[1] 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所,苏州,215123 ^[2] 中国科学院合肥物质研究院,合肥,230031 ^[3]

关键词硫胺素焦磷酸核酶开关增强绿色荧光蛋白基因表达调控荧光生物传感器哺乳细胞 Thiamine pyrophosphate ribozyme switches Enhanced green fluorescence protein Gene expression regulation Fluorescent biosensors Mammalian cells

栏目名称 研究报告

DOI 10.11895/j.issn.0253-3820.160688

发布时间 2017-05-03

基金项目

国家自然基金资助项目 江苏省青年基金资助项目(Nos.BK20130357,BK20130351)资助 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China the Natural Science Foundation of Jiangsu Province