摘要目的 探讨柴胡提取物中的活性成分柴胡皂苷D(Saikosaponin D)对胰腺癌细胞(Panc-1)凋亡的诱导作用,并分析其可能的作用机制.方法 本研究设置3个研究组:对照组、10 μmol/L柴胡皂苷D组和20 μmol/L柴胡皂苷D组.采用平板克隆形成实验检测柴胡皂苷D对Panc-1细胞增殖的影响;采用Annexin V-FITC和PI荧光染色法在荧光显微镜下观察柴胡皂苷D对Panc-1细胞凋亡的影响;采用流式细胞仪进一步分析柴胡皂苷D作用下Panc-1细胞的凋亡情况.采用β-半乳糖苷酶染色法,在光学显微镜下观察柴胡皂苷D对Panc-1细胞衰老的影响.采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测20 μmol/L柴胡皂苷D作用下,半胱天冬酶-3(Caspase-3)、半胱天冬酶-6(Caspase-6)、半胱天冬酶-7(Caspase-7)、半胱天冬酶-8(Caspase-8)和半胱天冬酶-9(Caspase-9)凋亡基因的表达情况;采用蛋白免疫印迹法(WB)检测20 μmol/L柴胡皂苷D作用下,Caspase-3、活化的Caspase-3(cleaved caspase-3)、丝裂原活化蛋白激酶(p38)、活化的p38(p-p38)、蛋白激酶B(AKT)、活化的AKT(pAKT)蛋白表达水平.结果 与对照组相比,柴胡皂苷D作用后Panc-1细胞集落形成率显著降低(F=8.07,P<0.05).Annexin V-FITC和PI染色结果显示,柴胡皂苷D处理可显著增强凋亡Panc-1细胞相关荧光信号,并提高流式检测中的总凋亡率,最高达79.14%.β-半乳糖苷酶染色中,蓝色颗粒沉淀增多,提示柴胡皂苷D可诱导Panc-1细胞衰老.qRT-PCR检测凋亡相关基因表明,20 μmol/L柴胡皂苷D作用下,Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8和Caspase-9的mRNA表达量均明显增加(Caspase-3:t=-5.5713,P=0.0099;Caspase-6:t=-4.4721,P=0.0141;Caspase-7:t=-3.7639,P=0.0267;Caspase-8:t=-6.0000,P=0.0075;Caspase-9:t=-8.0000,P=0.0031).WB实验结果表明,柴胡皂苷D可上调cleaved Caspase-3和p-p38蛋白表达,且p38抑制剂SB203580可部分逆转该效应,提示其凋亡诱导作用可能通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路实现;柴胡皂苷D处理后AKT与cleaved Caspase-3表达上升,而AKT激动剂SC-79可部分抑制cleaved Caspase-3的上调,表明AKT通路激活可能拮抗柴胡皂苷D的促凋亡作用.结论 本实验研究表明,柴胡皂苷D可以诱导胰腺癌细胞的凋亡;其作用机制可能与MAPK及AKT信号通路的调控有关.